人源溶菌酶在大肠杆菌中的表达与复性研究

人源溶菌酶(Human lysozyme,HLZ)是一种糖苷水解酶,具有抗菌消炎的作用,其作为抗生素的替代品,已经被广泛应用于食品业、畜牧业和医疗等领域。如何获得高产量、高活性、高纯度的人源溶菌酶一直是亟待解决的技术问题。优化人源溶菌酶编码基因密码子,提高其在大肠杆菌中的适应度和表达量;将优化的基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET21a,并将其在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达;利用8 mol/L尿素溶液对包涵体进行溶解变性后,探究一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式以及复性液中谷胱甘肽氧化还原对(GSSG/GSH)、精氨酸、甘油等复性物的浓度对重组人源溶菌酶复性的效果,获得最佳的复性方案。研究结果表明:37℃诱导温度下,利用0.5 mmol/L IPTG成功诱导了分子量约为14.7 kD的重组人源溶菌酶的表达,包涵体表达量约为380 mg/L(湿重)。包涵体经一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式复性后,测得比活力值分别为147 U/mg、335 U/mg、176 U/mg,表明最佳复性方法为梯度透析复性法。进一步探索了复性液中GSSG/GSH比值、精氨酸浓度、甘油浓度对人源溶菌酶复性效果的影响,表明当复性液中同时添加浓度比为1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油时,复性后人源溶菌酶的最佳比活力值为1170 U/mg,显著高于3种复性物均不加时溶菌酶335 U/mg的比活力值,但低于溶菌酶标准品1732 U/mg的比活力值。成功地将人源溶菌酶基因在大肠杆菌中表达,并通过包涵体复性体系成功获得高活性重组人源溶菌酶。

人源类溶菌酶蛋白4的多克隆抗体制备及其表达分析

目的:以原核表达的人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)为免疫原制备多克隆抗体,检测LYZL4在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供依据。方法:将LYZL4编码基因克隆于原核表达载体pET32a,IPTG诱导重组LYZL4(r LYZL4)表达。分别使用Ni-NTA树脂和甲壳素亲和层析纯化rLYZL4,采用双层琼脂平板扩散法检测杀菌活性。以Ni-NTA树脂纯化产物为免疫原制备兔抗rLYZL4多克隆抗体,通过ELISA测定抗体效价,Western印迹检测抗体特异性后,检测LYZL4蛋白在人体各组织的分布及其在精子和精浆中存在情况,免疫组化确认LYZL4在人睾丸组织中的定位。结果:原核表达系统可有效表达rLYZL4,其对溶壁微球菌及大肠杆菌无杀灭活性。制备的兔抗rLYZL4多克隆抗体具有很高的效价和特异性,在睾丸、附睾及人精子蛋白提取物中可检测到LYZL4存在,在生精小管中,LYZL4定位于圆形精子细胞及长形精子细胞的顶体上。结论:本研究成功以原核表达的rLYZL4制备了该蛋白的多克隆抗体,确认LYZL4在睾丸和附睾有表达,并定位于精子顶体上,提示其可能与顶体结构或功能相关。

人源类溶菌酶蛋白6在男性生殖系统中的表达

目的:检测人源类溶菌酶蛋白6(LYZL6)在男性生殖系统中的表达情况,以揭示其可能的生理功能。方法:将整合LYZL6编码基因的毕赤酵母菌株进行高密度培养,甲醇诱导表达后甲壳素亲和色谱纯化。采用双层琼脂平板扩散法观察重组LYZL6的杀菌活性。以纯化的重组蛋白为免疫原制备兔抗LYZL6多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。通过Western印迹检测LYZL6蛋白在人各组织及精液中的分布,并采用免疫组化法确认LYZL6在人睾丸中的表达情况。结果:在低p H条件下重组LYZL6对溶壁微球菌杀菌活性较高。以重组LYZL6为免疫原制备的抗体具有高效价,Western印迹检测表明LYZL6仅在睾丸和附睾中表达,且睾丸表达水平较高。在人精子蛋白提取物中检测到了LYZL6,精浆中并未检测到明显蛋白条带。免疫组化检测显示在睾丸组织中,LYZL6定位于晚期精母细胞及圆形精子细胞。结论:在低p H条件下,重组LYZL6具有较强的溶解细菌细胞壁的能力;LYZL6被睾丸上皮分泌后结合于精子上,提示LYZL6有可能在精卵融合过程的某个环节发挥作用。

人源类溶菌酶蛋白4在受精过程中的作用及酶学性质研究

目的:对人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)在受精过程中的作用和重组蛋白的酶学性质进行研究,从而揭示LYZL4的生理功能。方法:细胞免疫荧光法检测LYZL4在精子细胞上的亚细胞定位,RT-PCR分析精子表面LYZL4的来源,通过精子穿透试验分析LYZL4在受精过程中的作用。构建真核重组表达载体p PIC9K-LYZL4,转化毕赤酵母GS115菌株后,甲醇诱导表达;甲壳素亲和层析和凝胶过滤层析从发酵上清中纯化重组LYZL4蛋白(rLYZL4),通过Western印迹进行验证。ELISA测定rLYZL4的透明质酸结合能力,分光光度法测定rLYZL4的胞壁质酶活性、透明质酸酶活性和自由基清除能力。结果:LYZL4免疫荧光定位于成熟精子头部的顶体膜上,RTPCR检测表明精子表面的LYZL4蛋白来源于睾丸和附睾的分泌,兔抗LYZL4多克隆抗体可明显抑制精卵结合。毕赤酵母表达系统成功表达了rLYZL4,酶活性分析显示rLYZL4无胞壁质酶和透明质酸酶活性,但能够结合透明质酸,并具有较强的自由基清除能力。结论:LYZL4由睾丸和附睾分泌后定位于成熟精子头部的顶体膜上,可在精卵结合过程中发挥作用,其还能够结合透明质酸并清除自由基,提示LYZL4可能作为一种多功能分子在精子保护及精卵结合过程中发挥作用。

整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达

人源溶菌酶作为一种天然的抑菌活力物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。本研究将信号肽序列和人源溶菌酶基因碱基序列作为一个整体进行密码子优化。并在优化的信号肽序列2处位置,共新插入39个碱基,构成增长的优化信号肽+溶菌酶优化基因。将2种优化的信号肽+溶菌酶基因碱基序列分别插入pPICZαA载体上,并整合到毕赤酵母KM71的基因组上,获得重组子K1(整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因)和K4(整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因又整合了增长信号肽)。摇瓶诱导表达72 h后,离心取上清液,通过Bradford法和比浊法测定发现,K4的蛋白质表达量和酶活力均高于K1。5 L发酵罐下,采用高密度诱导表达策略,诱导54 h后K4的总蛋白质表达量可达3.02 g/L,所表达的人源溶菌酶活力达到324 072.0 U/ml。表明整体优化的α信号肽+人源溶菌酶基因又整合了增长信号肽有利于提高溶菌酶的分泌效率,实现高效表达。

人源类溶菌酶蛋白6在毕赤酵母中的重组表达及活性分析

利用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人源类溶菌酶蛋白6(human lysozyme-like protein6,h Lyzl6),对其酶学性质进行分析。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成h Lyzl6基因,将其连接至含有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的p PIC9K质粒构建重组表达载体p PIC9K-hlyzl6;重组表达载体经线性化后电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选获得高拷贝重组菌株后进行甲醇诱导表达。经甲醇诱导72 h后发酵液上清中酶活性达到最高值,发酵液上清经SDSPAGE检测在14.8 k Da处有重组h Lyzl6蛋白条带,分子量符合预期,通过甲壳素亲和层析可对其进行纯化;采用比浊法测定h Lyzl6酶学活性,结果表明h Lyzl6对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)有较好的杀灭作用,最适反应温度为40℃,最适p H为5.5,其酶活力为54 700U/mg,Cu2+对其活性有明显抑制,EC50为30.2799 mg/L。采用基因工程方法首次在毕赤酵母GS115成功表达了重组h Lyzl6,证实其在体外具有杀菌活性,初步揭示h Lyzl6在男性生殖系统先天性免疫中发挥了一定作用,为进一步研究h Lyzl6的功能和应用开发奠定了基础。

人源类溶菌酶蛋白6的功能研究及生理特性分析

对人源类溶菌酶蛋白6（human lysozyme-like protein 6,LYZL6）在受精过程中的作用进行研究,并对重组LYZL6蛋白（recombinant LYZL6,r LYZL6）的生理特性进行分析,从而揭示其生理功能。细胞免疫荧光法确定LYZL6定位于成熟精子头部的顶体后区域,反转录PCR（RT-PCR）分析表明精子表面的LYZL6蛋白来源于睾丸和附睾的分泌,Western blot法分析表明精子获能前后表面LYZL6的量无明显改变。半透明带结合实验和精子穿透实验分析表明兔抗LYZL6血清未明显抑制人精子结合透明带,但可明显抑制精卵融合。利用毕赤酵母表达系统成功表达了r LYZL6,使用甲壳素亲和层析和凝胶过滤层析可从发酵上清中纯化到具有生物活性的r LYZL6。酶联免疫吸附法（ELISA）分析显示r LYZL6不具有透明质酸结合能力、透明质酸水解能力和自由基清除活性,但具有较强的肽聚糖结合能力和异肽酶活性。LYZL6由睾丸和附睾分泌后定位于成熟精子头部的顶体后区域,可以参与精卵融合,并具有肽聚糖结合能力和异肽酶活性,提示LYZL6可能通过多种机制参与精子功能。

不同月龄牦牛睾丸中LYZL4、LYZL6的基因表达及蛋白质定位

为探讨人源类溶菌酶蛋白4(Human lysozyme-like protein4,LYZL4)和人源类溶菌酶蛋白6(Human lysozyme-like protein 6,LYZL6)在牦牛睾丸中的表达机制,分别选取6、18、30、72月龄健康的牦牛12头(每组3头)采集睾丸组织。应用qRT-PCR、Western-blot和免疫组化技术分别分析了LYZL4和LYZL6在不同月龄牦牛睾丸中的表达和定位。结果显示,在不同月龄牦牛睾丸中均检测到 LYZL4、LYZL 6 基因和相关蛋白质的表达,其基因表达量随着牦牛月龄增加呈现上升趋势。72、30月龄牦牛睾丸中 LYZL4、LYZL 6 基因及蛋白质的表达量极显著高于6月龄和18月龄牦牛( P < 0.01)。LYZL4蛋白在6月龄牦牛睾丸中定位于间质细胞内,在18月龄牦牛睾丸中主要定位于精原细胞和支持细胞内,在30、72月龄牦牛睾丸中定位于圆形精子细胞内。而LYZL6蛋白在6月龄牦牛的睾丸中定位于间质细胞内,在18月龄牦牛睾丸中主要定位于精原细胞内,在30、72月龄牦牛睾丸中定位于圆形精子细胞和初级精母细胞内。 LYZL4和LYZL 6 基因主要在牦牛性成熟后高丰度表达,而在性成熟前相对低丰度表达。因此,在牦牛雄性生殖系统的发育过程以及在精子发生的调控过程中LYZL4和LYZL6均发挥着重要的作用。