人源类溶菌酶蛋白4的多克隆抗体制备及其表达分析

目的:以原核表达的人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)为免疫原制备多克隆抗体,检测LYZL4在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供依据。方法:将LYZL4编码基因克隆于原核表达载体pET32a,IPTG诱导重组LYZL4(r LYZL4)表达。分别使用Ni-NTA树脂和甲壳素亲和层析纯化rLYZL4,采用双层琼脂平板扩散法检测杀菌活性。以Ni-NTA树脂纯化产物为免疫原制备兔抗rLYZL4多克隆抗体,通过ELISA测定抗体效价,Western印迹检测抗体特异性后,检测LYZL4蛋白在人体各组织的分布及其在精子和精浆中存在情况,免疫组化确认LYZL4在人睾丸组织中的定位。结果:原核表达系统可有效表达rLYZL4,其对溶壁微球菌及大肠杆菌无杀灭活性。制备的兔抗rLYZL4多克隆抗体具有很高的效价和特异性,在睾丸、附睾及人精子蛋白提取物中可检测到LYZL4存在,在生精小管中,LYZL4定位于圆形精子细胞及长形精子细胞的顶体上。结论:本研究成功以原核表达的rLYZL4制备了该蛋白的多克隆抗体,确认LYZL4在睾丸和附睾有表达,并定位于精子顶体上,提示其可能与顶体结构或功能相关。

人源类溶菌酶蛋白4在受精过程中的作用及酶学性质研究

目的:对人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)在受精过程中的作用和重组蛋白的酶学性质进行研究,从而揭示LYZL4的生理功能。方法:细胞免疫荧光法检测LYZL4在精子细胞上的亚细胞定位,RT-PCR分析精子表面LYZL4的来源,通过精子穿透试验分析LYZL4在受精过程中的作用。构建真核重组表达载体p PIC9K-LYZL4,转化毕赤酵母GS115菌株后,甲醇诱导表达;甲壳素亲和层析和凝胶过滤层析从发酵上清中纯化重组LYZL4蛋白(rLYZL4),通过Western印迹进行验证。ELISA测定rLYZL4的透明质酸结合能力,分光光度法测定rLYZL4的胞壁质酶活性、透明质酸酶活性和自由基清除能力。结果:LYZL4免疫荧光定位于成熟精子头部的顶体膜上,RTPCR检测表明精子表面的LYZL4蛋白来源于睾丸和附睾的分泌,兔抗LYZL4多克隆抗体可明显抑制精卵结合。毕赤酵母表达系统成功表达了rLYZL4,酶活性分析显示rLYZL4无胞壁质酶和透明质酸酶活性,但能够结合透明质酸,并具有较强的自由基清除能力。结论:LYZL4由睾丸和附睾分泌后定位于成熟精子头部的顶体膜上,可在精卵结合过程中发挥作用,其还能够结合透明质酸并清除自由基,提示LYZL4可能作为一种多功能分子在精子保护及精卵结合过程中发挥作用。

不同月龄牦牛睾丸中LYZL4、LYZL6的基因表达及蛋白质定位

为探讨人源类溶菌酶蛋白4(Human lysozyme-like protein4,LYZL4)和人源类溶菌酶蛋白6(Human lysozyme-like protein 6,LYZL6)在牦牛睾丸中的表达机制,分别选取6、18、30、72月龄健康的牦牛12头(每组3头)采集睾丸组织。应用qRT-PCR、Western-blot和免疫组化技术分别分析了LYZL4和LYZL6在不同月龄牦牛睾丸中的表达和定位。结果显示,在不同月龄牦牛睾丸中均检测到 LYZL4、LYZL 6 基因和相关蛋白质的表达,其基因表达量随着牦牛月龄增加呈现上升趋势。72、30月龄牦牛睾丸中 LYZL4、LYZL 6 基因及蛋白质的表达量极显著高于6月龄和18月龄牦牛( P < 0.01)。LYZL4蛋白在6月龄牦牛睾丸中定位于间质细胞内,在18月龄牦牛睾丸中主要定位于精原细胞和支持细胞内,在30、72月龄牦牛睾丸中定位于圆形精子细胞内。而LYZL6蛋白在6月龄牦牛的睾丸中定位于间质细胞内,在18月龄牦牛睾丸中主要定位于精原细胞内,在30、72月龄牦牛睾丸中定位于圆形精子细胞和初级精母细胞内。 LYZL4和LYZL 6 基因主要在牦牛性成熟后高丰度表达,而在性成熟前相对低丰度表达。因此,在牦牛雄性生殖系统的发育过程以及在精子发生的调控过程中LYZL4和LYZL6均发挥着重要的作用。