BIV在人源细胞MT-4中的活性研究

牛免疫缺陷病毒 (Bovineimmunodeficiencyvirus,BIV)在分类上属于反转录病毒科的慢病毒属 ,目前尚未见BIV感染人的报道。为进一步确定BIV对人源细胞的感染性 ,我们用BIV12 7cDNA转染人源细胞MT 4 ,通过RT PCR检测到BIVgag基因的转录 ,IFA则显示BIV12 7的 gag或 gag pol基因在MT 4细胞中得到了翻译 ,而RT值的测定也有力地说明BIV12 7cDNA已经在MT 4细胞内表达出有活性的反转录酶 ,但细胞传代实验表明BIV不能在MT

脂质体包被SARS-CoV-2 N基因的候选DNA疫苗转染人源细胞效率研究

利用脂质体包被含有SARS-CoV-2核衣壳蛋白(nucleocapsid protein;N)基因的候选DNA疫苗,并检测其在人源细胞293T中的转染效率.将SARS-COV-2 N基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,DNA测序及转染后的质谱测序证明能够表达正确蛋白.利用脂质体包被pcDNA3.1-SARS-COV-2-N基因,并进行超离纯化、核酸电泳、透射电镜等检测发现形成50~100 nm的脂质体纳米颗粒,定量后将纳米颗粒转染293T细胞,并对比脂质体转染与FUGENE~?HD试剂转染效果,表明制备的候选重组脂质体DNA疫苗能够形成稳定的纳米颗粒,并可在人源细胞293T中高效表达.

人源细胞对猪内源性逆转录病毒易感性的初步研究

目的 对 6种人源细胞对猪内源性逆转录病毒 (PERV)的易感性进行研究。方法 用PERV病毒上清感染培养中的 6种人源细胞后 ,用PCR和RT -PCR法研究PERV是否感染这 6种人源细胞。结果 张氏肝细胞和人胚软骨细胞对PERV不易感 ,其余 4种人源细胞对PERV易感。

高良姜素通过下调lncRNA H19的表达抑制ox-LDL诱导的人源 正常主动脉内皮细胞血管生成活性

目的探索高良姜素对ox-LDL诱导的人源正常主动脉内皮细胞(HAECs)的影响及其机制。方法使用不同浓度(0、10、20、40、80μmol/L)的高良姜素孵育HAECs24h后,通过MTT检测细胞活性。以5mg/mLox-LDL诱导的HAECs为模型,使用20、40μmol/L高良姜素孵育24h。为观察高良姜素的作用机制,在HAECs中过表达lncRNAH19,使用40μmol/L高良姜素孵育24 h。通过qRT-PCR检测lncRNAH19的水平,划痕实验和血管形成实验用于观察迁移和管形成能力,使用流式细胞术检测ROS水平。通过Western blot检测VEGFA、MMP-2、MMP-9的蛋白水平。结果低浓度(0、10、20、40μmol/L)的高良姜素对细胞无明显毒性(P>0.05),而80μmol/L高良姜素会抑制HAECs细胞的活性(P<0.01)。ox-LDL诱导的HAECs中lncRNAH19的表达水平增加,高良姜素能降低ox-LDL诱导的HAECs的lncRNAH19的表达水平、迁移能力和血管形成能力,ROS水平以及VEGFA、MMP-2、MMP-9的蛋白水平(P<0.01)。但是,高良姜素的这些生物学作用均能被过表达lncRNAH19逆转(P<0.01)。结论高良姜素可能通过抑制lncRNAH19的表达以降低ox-LDL诱导的HAECs的迁移、氧化应激和血管形成能力来发挥治疗动脉粥样硬化的潜力。

不同人源性细胞中内参基因的筛选

目的为筛选在不同人源性细胞中能够稳定表达的内参基因,以期为不同组织的定量研究提供一定的参考。方法通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测36种人源性细胞中β-珠蛋白(β-Globin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核糖体RNA(18S rRNA)和核糖核酸酶P(Rnase P)4个候选内参基因的表达量,并利用geNorm、NormFider和BestKeeper三个软件对候选内参基因的稳定性进行评价。结果同一种细胞中,Rnase P的表达量较高;不同细胞中,18S rRNA的表达较为稳定。结论综合分析发现候选内参基因18S rRNA虽较为稳定,但并不是最优选择。

蜜环菌β-1,6-葡聚糖通过调节人源巨噬细胞极化发挥抑制结肠癌作用

以人源巨噬细胞THP-1诱导的M2型巨噬细胞为模型,研究从蜜环菌中分离纯化出的β-1,6-葡聚糖(AAMP-A70)对其极化影响,并分析AAMP-A70通过调节巨噬细胞极化抑制结肠癌细胞DLD-1增殖的作用及机制.采用酶联免疫吸附测定(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测AAMP-A70处理前后THP-1诱导的M2型巨噬细胞中M1型和M2型巨噬细胞标志物表达情况;将各处理组的细胞培养液处理DLD-1细胞,通过MTT和结晶紫染色检测DLD-1细胞的增殖情况;并通过Western-blot实验检测DLD-1细胞的凋亡蛋白表达情况.实验结果表明:AAMP-A70可显著下调M2型巨噬细胞标志物VEGF,Arg-1,TGF-β的表达,促进M1型巨噬细胞标志物TNF-α,IL-1β,CCR7的表达;AAMP-A70处理组细胞的培养液可显著抑制DLD-1的增殖,且呈浓度依赖趋势;AAMP-A70处理组的细胞上清液可诱导DLD-1细胞中表达的cleaved-PARP和cleaved-Caspase-3上调.

STR图谱分析法鉴别人源细胞交叉污染

目的采用STR图谱分析法鉴别人源细胞交叉污染。方法采用PCR-毛细管电泳分析方法,分别检测人源、猴源及鼠源细胞以及人源细胞交叉污染模型的16个STR位点,分析STR图谱法用于细胞交叉污染检测的可行性。并对来自不同生物制品生产单位的27株生产用细胞及5株组织工程医疗产品用细胞进行STR图谱分析。结果STR图谱分析方法具有人源细胞特异性,猴源细胞及鼠源细胞不产生特征性图谱。此方法可以对形态相似或不相似的人源细胞交叉污染模型进行明确鉴别。采用此方法检测的27株生物制品生产用人源细胞未发现有交叉污染现象,而5株组织工程医疗产品用细胞中,发现有2株为非单个个体的混合细胞。结论STR图谱分析法具有高特异性,可用于人源细胞间交叉污染或细胞个体来源的鉴别。

猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞模型的建立

目的 建立猪内源性反转录病毒感染HEK2 93细胞的模型 ,验证PERV在体外对人源细胞的感染性 ,并进一步研究PERV的生物学特性。方法 将G4 18抗性的HEK2 93细胞与猪源PK 15细胞共培养 ,6周后 ,用含有6 0 0 μg mlG4 18的选择性培养基对共培养细胞进行加压筛选 ,用以除去共培养体系中的PK 15细胞 ;然后应用PCR及RT PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。结果 经 6周共培养及 3周加压筛选后 ,细胞的形态、生长速度及折光性均未见明显变化 ;PCR及RT PCR鉴定表明 ,筛选后的共培养体系中已没有PK 15细胞的存在 ;PERV特异性检测方法检测显示 ,该细胞模型的DNA中已有PERV的整合且有PERV特异性mRNA的表达。结论 本实验成功建立了PERV感染HEK2 93细胞的模型 ,证实了PERV在体外对人源细胞具有感染性 ;

犬瘟热病毒体外感染人源细胞的分子研究进展

犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)是一种主要通过呼吸道传播对犬科动物造成严重危害的烈性传染病。近年随着CDV在灵长类动物中暴发,研究者开始关注CDV是否具有潜在感染人的风险。目前虽然无直接证据证明CDV可在人体内定殖,但CDV在体外能感染人源细胞,且人体内CDV关键受体SLAM和Nectin-4与灵长类动物具有极高的同源性,因此我们必须高度重视CDV对人类的潜在威胁。本文对CDV分子结构特征、CDV感染宿主靶细胞过程、CDV入侵宿主所需关键受体以及CDV野毒株体外感染人源细胞等方面进行综述,分析CDV对人是否具有潜在感染的风险。

人源细胞间黏附分子-1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

目的建立并验证细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并用该方法检测不同细胞中ICAM-1的基因水平。方法根据GenBank中登录的ICAM-1基因序列设计并合成引物,建立ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法,验证方法的适用性、线性范围、灵敏性、特异性及精密性。同时采用该方法对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、人星形神经胶质瘤细胞(u251)、人原发性肝癌细胞(PLC/PRF/5)、人胚肾细胞(HEK293)及人脐静脉内皮细胞(HuvEc)进行检测。结果该方法的溶解曲线峰单一,无非特异性产物和引物二聚体;标准质粒在6.74×104~6.74×109 copies/μL浓度范围内与Ct值呈良好的线性关系,线性方程为y=-3.576 log x+42.982,R2=1.000;建立方法的灵敏性是普通PCR法的10倍;该方法检测不同物种细胞无交叉反应,仅能检出人源细胞ICAM-1;批内和批间CV均<1%。不同组织来源的细胞内ICAM-1基因含量不同,其中MRC-5细胞含量最高。结论成功建立了ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,且具有良好的特异性、灵敏性及精密性,可用于ICAM-1基因的定量检测。

重组人源细胞珠蛋白单抗制备及检测方法建立

目的制备重组人源细胞珠蛋白(recombinanthumanCytoglobin,rhCygb)单克隆抗体,并建立检测该蛋白双抗体夹心ELISA法,为下一步研究rhCygb药代动力学做准备。方法用纯化的rhCygb免疫BALB/c小鼠,采用甲基纤维素半固体培养基法获得抗rhCygb的单克隆抗体杂交瘤细胞,间接ELISA法筛选制备单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA法。结果筛选获取了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过抗原表位相加法实验获得5株表位不同的细胞株,Western-blotting验证能与rhCygb特异性结合,间接ELISA法验证其不与本实验室制备的其它PET28a-BL21蛋白及BL21裂解液发生交叉反应。本方法灵敏度为1.25ng/ml,在浓度为10～1250ng/ml时,线性关系良好,相关性达0.9931,实验内和实验间平均变异系数分别为6.2%和10.92%。结论成功建立了灵敏度好、特异性高的双抗体夹心法,为下一步研究rhCygb药代动力学奠定了基础。

HCVNS3蛋白对正常人源肝细胞生长及MAPK磷酸化的影响

目的:研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCVNS3)蛋白对正常人源肝细胞的转化及MAPK磷酸化调节的作用.方法:利用脂质体介导转染技术和G418筛选得到稳定表达NS3蛋白的正常人源性肝细胞QSG7701,PCR和免疫组化S-P法检测细胞中NS3的表达;细胞记数和软琼脂实验鉴定其生物学性质;抗磷酸化MAPK抗体和抗MAPK抗体Westernblot检测转染细胞MAPK活性及表达.结果:HCVNS3转染的QSG7701肝细胞,其NS3蛋白过度表达于细胞质;真核表达质粒pRcHCNS3-5’转染细胞倍增时间为12h,较pRcHCNS3-3’、pRcCMV转染细胞和未转染的QSG7701明显缩短(分别24h,26h和28h).pRcHCNS3-5’、pRcHCNS3-3’和pRcCMV转染细胞及正常肝细胞在软琼脂中的克隆形成率分别为33%、1.33%、1.46%、1.11%,pRcHCNS3-5’形成的克隆明显高于其他三种细胞(P<0.01).pRcHCNS3-5’转染细胞MAPK磷酸化程度明显高于其他三种细胞(分别为8858±877,5612±656,2212±245和989±188).(P<0.01),而MAPK的表达量没有差异(P>0.05).结论:人源性正常肝细胞QSG7701是研究HCVNS3蛋白致病机制的较好的细胞系;HCVNS3蛋白N端多肽具有促进细胞增生和改变细胞表型的作用;HCVNS3蛋白N端多肽能上调MAPK活性,不影响MAPK的表达量.

用于重组药物蛋白生产的人源化细胞系研究进展

哺乳动物细胞表达系统由于存在翻译后加工修饰(PTMs)机制,能够产生分子量大、结构复杂的蛋白,是重组药物蛋白生产的优选系统。虽然非人源化的哺乳动物细胞系的PTMs与人源化细胞类似,但仍能进行人源化细胞不存在的其他PTMs,表达药物蛋白存在免疫原性、改变药物代谢动力学等缺点。近年来,人源化的细胞系已经用于治疗重组药物蛋白的生产,此类细胞系的优点在于具备和人源细胞完全一致的PTMs,表达的蛋白活性高、疗效好。目前用于重组药物蛋白生产及临床前研究的人源细胞系主要有HEK293、HT-1080、PER.C6等。本文综述了人源化细胞用于重组药物蛋白的最新进展。

重组人源肝星状细胞激活相关蛋白体外生物活性的研究

文章表达、纯化了重组人源肝星状细胞激活相关蛋白,研究了其抗氧化的生物活性和对次氮基三乙酸铁造成的大鼠肝星状细胞氧化应激的抑制作用。结果显示重组人源肝星状细胞激活相关蛋白具有抗氧化的生物活性,活性为(80.0±3.0)U/mg;可抑制次氮基三乙酸铁对肝星状细胞造成的氧化应激,具体表现为可以降低丙二醛、羟脯氨酸的含量,提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活力,并且抑制肝星状细胞的增殖。重组人源肝星状细胞激活相关蛋白对肝星状细胞氧化应激的抑制作用具有剂量依赖关系,浓度大于或等于10μg/mg,即有明显的作用。

人源细胞激活试验法应用于中药注射剂过敏反应检查的研究

目的研究体外人源细胞激活试验法(human cell line activation test,h-CLAT)用于中药注射剂过敏反应检查的可行性,探讨中药注射剂的Ⅳ型变态反应体外检测的可行性。方法参考OECD指导原则442E的h-CLAT法,应用流式细胞仪在类树突样的人源白血病细胞系THP-1上对4种中药注射剂进行体外过敏反应检查,根据THP-1细胞表面抗原CD86和CD54的相对荧光强度评价4种中药注射剂体外过敏反应;同时采用体内过敏反应对4种注射剂进行评价。结果体外皮肤过敏试验表明,树突状细胞表面特异抗原CD86相对荧光强度值<150,CD54的相对荧光强度值<200,根据判定标准结果为阴性,与体内法结果一致。结论 h-CLAT法具有检验周期短、测试方法简便、评价客观等优点,是一种较好的检查中药注射剂过敏反应的替代方法。

人源多能干细胞体外定向诱导分化为肝细胞

目的:探索人源诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在体外二维条件下诱导分化生成肝细胞的条件,并初步探讨三维条件下hiPSCs的肝细胞诱导分化。方法:通过测定4种诱导培养基中白蛋白和甲胎蛋白含量,筛选诱导分化的最佳方案。用筛选出的最优培养基对hiPSCs进行二维培养,采用免疫荧光法、蛋白质印迹法检测诱导后的细胞中肝脏标志蛋白的表达,采用酶联免疫吸附法检测肝细胞功能相关蛋白的含量;对hiPSCs进行三维培养,用酶联免疫吸附法对比二维与三维条件下肝细胞功能,并用HE染色法观察三维条件下形成细胞的形态。结果:二维条件下诱导分化23 d,倒置显微镜下细胞呈典型的肝细胞形态;免疫荧光法、蛋白质印迹法检测到诱导分化后的细胞阳性表达肝脏特征蛋白(甲胎蛋白、白蛋白、角蛋白CK8、角蛋白CK18、SOX17),且与胚胎干细胞来源肝细胞(hESCs-HEPs)内含量相近;酶联免疫吸附法测定结果显示,诱导形成的肝细胞具有正常肝细胞功能,表明hiPSCs已分化为肝细胞;HE染色结果显示三维条件下诱导形成的细胞具有明显双核,呈现典型肝细胞形态;酶联免疫法测定结果显示,三维条件下,诱导形成的肝细胞功能没有受到损伤,仍具有正常肝细胞功能。结论:在二维与三维培养体系下,采用最佳诱导分化方案,hiPSCs能够被诱导分化为肝细胞,且表达肝脏相关蛋白,并具有正常肝细胞功能。

重组人促红细胞生成素干预人源羊水干细胞向心肌前体细胞的分化

背景:研究发现人源羊水干细胞可向心肌前体细胞分化。目的:观察不同浓度重组人促红细胞生成素对人源羊水干细胞向心肌前体细胞分化的影响。方法:用含0,1.0,5.0,10.0,20.0U/mL重组人促红细胞生成素的诱导培养基诱导鉴定后的人源羊水干细胞向心肌前体细胞分化,诱导24h后换为完全培养基继续培养。结果与结论:诱导分化14d,倒置显微镜下可见细胞由长梭形逐渐变短增宽,相邻的细胞间有融合现象,似类肌管样结构,以5.0U/mL重组人促红细胞生成素的诱导分化率最高;RT-PCR检测显示重组人促红细胞生成素可促进细胞Nkx-2.5和GATA-4mRNA的表达,以5.0U/mL重组人促红细胞生成素的作用最强。说明外源性重组人促红细胞生成素能剂量依赖性促进人源羊水干细胞向心肌前体细胞分化。

内皮素拮抗剂抑制人源性喉癌Hep-2细胞VEGF-C体外表达的定量分析

通过影响人源性喉癌Hep-2细胞中血管内皮生长因子C（VEGF—C）表达，探讨内皮素拮抗剂（BQ-123）与喉癌淋巴转移的机制，为临床及基础研究提供相应的实验依据．体外培养人源性喉癌Hep-2细胞，运用酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞培养液中VEGF—C的含量；利用M1-r比色法，测定不同浓度的内皮素拮抗剂对人源性喉癌Hep-2细胞增殖的影响．实验中发现当浓度分别为20．0～150．0μg／mLBQ-123作用48h，对人源性喉癌Hep-2细胞增殖有显著抑制作用（P〈0．05）；浓度分别为50．O～150．0μg／mLBQ-123对人源性喉癌Hep-2细胞VEGF—c蛋白分泌量有明显抑制活性作用（P〈0．05）．BQ-123可以有效抑制人源性喉癌Hep-2细胞中VEGF—C体内的表达．

人源脐带间充质干细胞移植治疗大鼠佐剂骨关节炎的对照研究

目的探讨人源脐带间充质干细胞(hUc—MSCs)治疗大鼠佐剂骨关节炎(OA)的价值。方法将42只大鼠按抽签法分为7组,G组为正常对照组,其余6组进行右后肢膝关节注射0.1%碘乙酸0.1ml造模;A组造模后第6周处死(空白对照);B组造模后第6周注射0.9%氯化钠溶液,第10周处死;C组造模后第6、8周2次注射0.9%氯化钠溶液,第12周处死;D组造模后第6周1次关节腔注射hUc—MSCs,第10周处死;E组造模后第6、8周2次关节腔注射hUc—MSCs,第12周处死;F组造模后第6、8周2次尾静脉注射hUc—MSCs,第12周处死;各组大鼠造模前后和注射后测定关节肿胀度和疼痛评分;处死后取关节组织病理检查。结果 D、E组较B、C组的关节肿胀度均有减小,E组的消肿作用更显著;而F组的消肿作用不明显;D、E组关节疼痛评分较B、C组均有缓解,E组止痛作用更显著;F组的止痛作用与E组相当。Mankin关节软骨病理分级积分结果提示:D组与B组比较无统计学差异;F组低于C组;而E组低于F组。病理检查提示:A组造模后第6周关节组织病理检查类似于OA病理表现,无宿主与移植物的相互排斥反应发生;B组表现类似A组,C组关节病理破坏较B组重;D组滑膜重度增生侵入关节腔,炎症细胞浸润,其病理破坏较A组重,较C组轻,并且软骨染色较浅;E组滑膜增生和炎症较D组轻,软骨染色较D组更浅;F组关节病理表现与E组基本相仿;在饲养、造模、注射、观察的实验过程中,无明显局部或者全身的宿主与移植物相互排斥反应发生,未发现注射部位、关节感染、坏死等不良反应,无意外疾病和死亡发生。结论 2次关节腔注射和尾静脉注射hUc—MSCs均能较好缓解碘乙酸佐剂OA的疼痛,改善滑膜炎症修复软骨等作用,而且2次关节腔注射hUc—MSCs能更明显能消除关节肿胀,减轻滑膜炎症和软骨损害的病理改变;无明显的不良反应发生;hUc—MSCs治疗OA具有良好的有效性和安全性。

纯化人源骨髓单克隆间充质细胞移植更利于梗死心脏功能恢复

目的通过制备大鼠心肌梗死模型,分别移植经纯化了的人源骨髓单克隆间充质干细胞(SCMSCs)、未纯化的间充质细胞和单个核细胞及外周血单个核细胞,旨在比较SCMSCs移植是否更有利于心脏功能改善。方法应用磁珠分选和极限稀释细胞培养方法获取SCMSCs,利用贴壁培养方法得到未纯化的骨髓间充质细胞,利用梯度密度离心法得到骨髓单个核细胞和外周血单个核细胞。流式细胞仪分析所得细胞特性后,将其移植到梗死心脏。术后1个月,应用血流动力学技术检测大鼠心脏功能,随后取材,以免疫荧光检测移植细胞的分化情况,用碱性磷酸法计算血管密度。结果流式分析结果显示,SCMSCs99%以上表达间充质干细胞标记蛋白,阴性表达造血细胞标记蛋白。功能检测显示,移植SCMSCs心脏收缩功能(LVdP/dtmax)较明显高于其他各组。血管计数显示,SCMSC组血管密度明显高于其他各组。免疫荧光结果显示,移植的SCMSCs向心肌细胞和血管内皮细胞转化效率明显高于其他骨髓细胞,外周血细胞并不发现分化。结论经纯化均一的SCMSCs移植较目前常用的未纯化、不均一的干细胞移植更利于梗死心脏收缩功能恢复。