用人源肠毒素性大肠杆菌CS3菌毛构建新型呈现载体(英文)

根据对人源大肠杆菌菌毛CS3亚单位亲水性、表位、二级结构和柔韧性计算机预测结果 ,以CS3亚单位第 72位氨基酸残基之后作为外源表位的插入位点 ,构建了一种新的表面呈现载体pCSX72。用该载体分别表达口蹄疫病毒 (FMDV)的VP1表位和C -myc的十肽表位 (4 1 0～ 4 1 9aa)。SDS -PAGE结果以及电镜和免疫电镜观察证明 ,插入的外源表位和CS3亚单位以杂合菌毛的形式呈现在菌体表面。ELISA检测结果表明 ,pCSX72表达的杂合蛋白的抗原性较之其他插入位点的载体要高得多。用重组细菌腹腔免疫小鼠 ,能够诱发机体对杂合蛋白的双重免疫应答。

谷氨酰胺对肠产毒素性大肠杆菌感染小鼠肠道损伤的保护作用

【目的】探究谷氨酰胺(glutamine,Gln)对肠产毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)感染小鼠肠道损伤的保护作用,为Gln缓解大肠杆菌性肠损伤提供理论依据。【方法】选取健康的SPF级昆明小鼠24只,随机分为3组:对照组(Con)、模型组(ETEC)、Gln干预组(ETEC+Gln)。Con和ETEC组小鼠采用灌胃方式每天给予0.2 mL生理盐水,ETEC+Gln组小鼠给予0.2 mL 1%Gln,于试验第7天,ETEC和ETEC+Gln组小鼠采用灌胃方式给予0.2 mL 8.6×109 CFU/mL ETEC K88,试验期10 d。每天对小鼠进行称重;采用HE和PAS染色观察空肠病理变化;采用ELISA法检测血清炎症因子的浓度;采用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测空肠炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ)、紧密连接蛋白(Occludin、Claudin-1、ZO-1)、肠上皮细胞增殖(TGF-β1、PCNA、EGF)和凋亡(Bax、Bcl-2)相关指标的mRNA和蛋白表达水平;采用免疫组化检测空肠Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的蛋白表达情况。【结果】与Con组相比,ETEC组小鼠体重显著下降(P<0.05),而Gln处理缓解了体重下降的趋势;ETEC组小鼠脾脏指数显著高于Con和ETEC+Gln组(P<0.05);与ETEC组相比,Gln处理显著提高了小鼠空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度比值、杯状细胞数量和黏液层厚度(P<0.05)。与Con和ETEC+Gln组相比,ETEC组小鼠血清IL-1β和TNF-α含量、D-乳酸(D-lac)浓度、二胺氧化酶(DAO)活性均显著升高(P<0.05);与ETEC组相比,Gln干预显著降低了小鼠空肠IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、TLR4、NF-κB p65和Bax的mRNA表达水平(P<0.05),显著增加了小鼠空肠Occludin、Claudin-1、ZO-1、Bcl-2、PCNA和TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。【结论】Gln干预可通过抑制肠道炎症反应、促进肠道上皮细胞增殖和提高肠上皮细胞紧密连接等缓解ETEC K88感染引起的小鼠肠道损伤。

猪源肠毒素性大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立

为了对猪源产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的4种主要菌毛(K 88、K 99、F 41和987p)进行快速检测和分型,建立了检测4种菌毛的多重PCR方法。首先设计合成4对4种菌毛特异性的引物,然后用4种菌毛参考ETEC菌株优化了多重PCR方法。该方法对K 88、K 99、F 41和987p 4种菌毛的扩增产物分别为201,314,380和459 bp。对4种扩增产物分别进行酶切鉴定,结果均得到与预期一致的2个片段。对各个参考菌株不同组合的检测结果为100%符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于ETEC性腹泻的辅助诊断及ETEC菌毛抗原分型检测。

牦牛源产肠毒素性大肠杆菌血清型和毒力基因调查

产肠毒素性大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli ETEC）是引起犊牛腹泻的重要病原菌.ETEC的致病过程是细菌依赖黏附素,在肠道内定居、繁殖,然后释放细菌毒素引起细胞坏死和肠道紊乱,进而导致急性腹泻[1].黏附素、肠毒素、溶血素等是与其致病过程有关的致病因子[2],某些血清型也与大肠杆菌的致病性有关.国外有关于大肠杆菌的O抗原血清型与肠毒素和黏附素类型之间关系的相关研究报道.本研究检测了分离自牦牛腹泻样品中的产肠毒素性大肠杆菌的血清型和毒力基因携带情况,为牦牛源产肠毒素性大肠杆菌病的预防和治疗提供了科学依据.

我国部分地区猪源大肠杆菌LEE和HPI毒力岛相关基因的检测

目的采用PCR方法检测我国江苏等9个省市部分地区分离的1 007株猪源大肠杆菌中肠细胞脱落位点毒力岛(LEE)和强毒力岛(HPI)。方法对LEE毒力岛检测其核心区的ler和eaeA基因,对HPI毒力岛检测其irp2和fyuA基因。同时对LEE和/或HPI阳性大肠杆菌进行了O血清型的鉴定。结果在分离的猪源大肠杆菌中,LEE毒力岛基因检测结果为:2.2%(22/1 007)的菌株ler和eaeA基因的扩增阳性,0.5%(5/100 7)的菌株eaeA阳性。HPI毒力岛基因检测结果为:10.6%(107/1 007)的菌株irp2和fruA基因扩增阳性,2.1%(21/1007)的菌株irp2阳性;其中有2株irp2和ler基因扩增阳性,有3株irp2、ler和eaeA基因扩增阳性,1株irp2f、yuA、ler和eaeA基因扩增都为阳性;在128个HPI阳性分离株中,O93和O107血清型菌株分别占定型菌株的15.7%(13/83)和12.0%(10/83)。结论2.7%的猪源大肠杆菌携带LEE,12.7%的菌株携带耶尔森菌HPI,O93和O107为猪源HPI大肠杆菌常见血清型。

产肠毒素性大肠杆菌致病因子F_(41)、K_(99)菌毛基因的克隆与表达

目的为了分析原核表达的ETECF41和K99菌毛亚单位的抗原性和作为基因工程亚单位疫苗的可能性。方法针对黏附素F41和K99的编码序列,设计两对特异性引物,扩增F41和K99菌毛蛋白的编码基因,经序列测定后,克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化E.coliBL21(DE3),筛选到可以表达F41和K99菌毛亚单位的菌株。经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot试验分析原核表达的F41和K99重组蛋白的抗原性。结果表达的F41和K99菌毛亚单位蛋白可以与抗F41和K99菌毛蛋白的单因子血清反应。结论原核表达的F41和K99重组蛋白具有良好的抗原性。

产肠毒素性大肠杆菌K88的致病特性及其益生菌的筛选

在获得绿色荧光蛋白(GFP)标记的菌株K88-GFP并证明其与K88具有遗传同质性的基础上,以K88-GFP为致病菌,腹腔注射侵染小鼠,在不同时间进行眼球采血,测定血液生理生化指标,并采取不同器官或组织,培养后利用紫外光激发K88-GFP的绿色荧光,观察计数这种产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)在小鼠体内的分布。同时通过体外抑制和活体饲喂试验,进行了益生菌的筛选。结果证实,ETEC致病菌具有较强的侵袭性,它可以侵袭小鼠肝、肾、心、肺及脑、肌肉等器官和组织,尤其可对肝、肾造成严重的损伤;筛选得到益生菌株PB JK-2,在体内外均对K88具有较好的抑制作用。

检测产肠毒素性大肠杆菌粘附素抗体间接ELISA的建立

为了评价仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41 四价亚单位疫苗的免疫效果,利用纯化粘附素为包被抗原,建立了检测产肠毒素性大肠杆菌粘附素抗体的间接ELISA。初步确定了各种反应条件: K88、K99、987P、F41粘附素抗原最适包被浓度依次为1∶400、1∶80、1∶40、1∶40,相应粘附素抗体最佳稀释度依次为1∶400、1∶200、1∶200、1∶200。经交叉试验、阻断试验和重复试验证实,本方法具有良好的特异性和重复性。

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达

应用 PCR从产肠毒素性大肠杆菌 ( ETEC)中扩增出不含信号肽序列的 K99菌毛蛋白基因片段 ,克隆测序后 ,将该片段连接到 E.coli表达载体 p ET2 8a( + )中 ,转化 E.coli表达菌株 BL2 1 ( DE3) ,筛选得到可诱导表达 K99抗原的工程菌株。经 IPTG诱导 ,分离纯化 K99重组蛋白 ,以其免疫新西兰大白兔 ,获得重组蛋白的兔抗血清 ;免疫印迹分析表明 ,此重组蛋白制备的抗血清能与标准的

产肠毒素性大肠杆菌肠毒素的研究概况

本文分析了大肠杆菌耐热肠毒素 (heat-stable,ST)和不耐热肠毒素 (heat- labile,LT)生物学特性、分子水平机制及其应用价值。一方面着重讲述 LT作为粘膜免疫佐剂的研究前景 ,利用体外定点突变方法构建不同的突变株并且均具有不同程度的佐剂活性 ,是霍乱毒素 (Choleratoxin,CT)很有希望的替代品。另一方面讲述ETEC基因工程亚单位疫苗的研究概况。ETEC只有 LT、ST两类肠毒素 ,通过不同方式构建融合基因探讨对 ETEC性腹泻防治效果。目前 ,这两方面均卓有成效 。

动物源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR快速检测研究

目的建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7及其3个主要毒力基因(hylA、eaeA和stx2基因)的多重PCR方法。方法根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素(hlyA)基因、紧密黏附素(eaeA)基因和志贺样毒素2(stx2)基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测。结果该方法扩增目的基因片段分别为327bp、247bp、494bp、384bp和779bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104cfu/mL。结论初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157∶H7的分子流行病学调查及食品微生物检测。

检测K88^+肠毒素性大肠杆菌PCR方法的建立

以K8 8菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了一对可扩增长 2 0 1bp的目的片段的引物 ,成功地建立了检测肠毒素性大肠杆菌(ETEC)K88菌毛基因的PCR方法。进行了PCR方法的特异性试验和敏感性试验。对K99+ ,F41 + ,987p+ 参考菌株和鼠伤寒沙门氏杆菌 ,链球菌 ,金黄色葡萄球菌和猪肺疫巴氏杆菌的检测结果均为阴性 ;该检测方法的敏感度可达 1 0个细菌。用此方法对 1 0株腹泻仔猪粪便分离物进行检测 ,结果有 2株阳性 ;与血清学检测的结果一致。结果表明此方法特异性和敏感性都很高 ,可用于临床K88+

肠毒素性大肠杆菌菌毛对产蛋鸡免疫性的研究

采用热抽提法提取4种肠毒素性大肠杆菌菌毛蛋白。K88、K99、F41和987p菌毛蛋白分别制成弗氏佐剂苗;K88还制成白油佐剂苗,氢氧化铝胶苗和蜂胶佐剂苗;另将4种菌毛等比例混合制成弗氏佐剂苗。分别对产蛋鸡进行免疫,用微量凝集反应和血凝抑制试验检测卵黄抗体效价。结果表明,K88菌毛较其他3种菌毛免疫性好,诱导抗体效价最高而且能长时间维持;987p菌毛能快速诱导抗体的产生,但整体效价低。K88不同佐剂苗中,铝胶佐剂能较快地诱导抗体的产生,蜂胶佐剂苗抗体持续时间短,弗氏佐剂能诱导高效价的抗体产生而且能长时间持续。

定量产肠毒素性大肠杆菌黏附素抗原反向间接血凝试验的建立

利用黏附素单因子血清IgG致敏绵羊红细胞,建立了定量产肠毒素性大肠杆菌黏附素抗原的反向间接血凝试验。该试验所用K88、K99、987P和F41单因子血清IgG致敏红细胞的最佳浓度依次为30μg/ml、56μg/ml、28μg/ml和100μg/ml。经交叉试验、抑制试验和敏感性试验证实,该试验具有很高的特异性和敏感性,可用于生物制品中黏附素含量的定量。

仔猪产肠毒素性大肠杆菌的血清学鉴定

从吉林省某些猪场采集发生典型黄白痢的仔猪粪便样品５５份，采用ＥＭＢ选择培养基进行分离培养，得到４３株大肠杆菌，用Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ３种因子血清分别进行玻片凝集试验。结果阳性菌株有２３株，其中１４株为Ｋ９９，占６０９％；５株为９８７Ｐ，占２１７％；３株含双粘附素（Ｋ９９、９８７Ｐ），占１３０％；只有１株为Ｋ８８，占４３％。

新型凝集技术快速检测产肠毒素性大肠杆菌菌毛的研究

为建立以彩色二氧化硅微球(CSN)为载体,快速检测产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)菌毛K88ab、K99、987p和F41的新型凝集技术,本研究采用反相微乳液法制备二氧化硅微球,将其与菌毛单因子血清偶联制成免疫彩色二氧化硅微球(ICSN),通过优化反应条件建立了快速检测ETEC菌毛的方法。特异性试验结果显示,ICSN只与携带其对应菌毛的菌株发生反应,与携带其它菌毛的菌株无交叉反应;敏感性试验结果显示菌液的最小检出浓度为1.0×10~6cfu/m L^5.1×10~6cfu/m L;稳定性试验显示4℃保存30 d,ICSN特异性、敏感性无明显变化;双盲样品检测准确率为100%。本研究有助于ETEC菌毛的快速检测和幼畜大肠杆菌性腹泻的诊断。

肠毒素性大肠杆菌疫苗研究现状

肠毒素性大肠杆菌（entertoxigenic escherichia coli，ETEC）是婴幼儿腹泻的主要病原菌。Wenneras等…估计每年全球5岁以下儿童因ETEC感染的病例高达2亿人次，ETEC也是到发展中国家旅游者腹泻的主要病原菌，30％～60％的旅游者腹泻由ETEC所致。一般认为ETEC属非侵袭菌，进入宿主体内后，由定居因子（colonization factor，CFs）黏附到小肠上皮细胞表面，

肉品中肠毒素性大肠杆菌和肠沙门菌多重PCR检测方法的建立

利用肠毒索性大肠杆菌（ETEC）的LT-A、ST-1毒素基因和肠沙门菌的iroB基因设计3对引物,建立能同时检测ETEC和肠沙门菌的多重PCR方法.结果：多重PCR扩增出了预计的PCR产物,本方法的特异性为100％、灵敏度达10102 CFU/mL,用建立的多重PCR方法对30份临床可疑腹泻样品进行检测并与生化试验比较,结果两种方法检出大肠杆菌和沙门菌的阳性符合率达100％.