聚氨酯介导TRIB2-siRNA转染人源脂肪干细胞的体外成脂分化

目的使用阳离子型聚氨酯(cationic polyurethane,CPU)介导TRIB2-siRNA体外转染人源脂肪干细胞沉默TRIB2基因表达,研究基因沉默效率及基因沉默对干细胞成脂分化的影响。方法在氮/磷(N/P)为10∶1的条件下,混合CPU与TRIB2-siRNA或阴性对照siRNA(NC)制备复合物,并转染人源脂肪干细胞。将CPU/TRIB2-siRNA作为实验组,CPU/NC作为阴性对照组,Lipofectamine^(TM)2000/TRIB2-siRNA作为阳性对照组,未处理的干细胞作为空白对照组,使用实时荧光定量PCR检测干细胞内TRIB2的mRNA表达;使用Alamar Blue法检测干细胞的存活率;应用激光共聚焦显微镜观察复合物的细胞吞噬情况;用油红O染色法在光学显微镜下观察干细胞的成脂情况。结果与空白对照组比,CPU/TRIB2-siRNA实验组有效沉默了TRIB2 mRNA,差异有统计学意义(P<0.001);实验组的沉默效果较阳性对照组更好(P<0.001);实验组的细胞存活率接近100%。CPU能介导TRIB2-siRNA在8 h后逃逸溶酶体。油红O染色及定量分析表明,实验组在诱导28 d后出现较多的脂滴。结论聚氨酯作为载体可有效递送TRIB2-siRNA进入脂肪干细胞并降低TRIB2 mRNA的表达,进而促进脂肪干细胞向脂肪的分化。

麦胚凝集素慢病毒载体的构建及其对脂肪干细胞的感染

目的探讨麦胚凝集素(WGA)慢病毒载体的构建与表达的方法,以及WGA在神经系统中跨膜示踪的能力。方法采用基因工程方法,将WGA的基因插入到慢病毒表达载体Plvx-IRES-Zs Green1中。再采用慢病毒包装,将构建好的质粒和其他3种包装质粒(RPEV、PRRE、VSVG)在293T细胞中进行共转染,获取病毒液后感染人源的脂肪干细胞(h ADSCs),将感染后的h ADSCs注入小鼠的脑卒中模型,修复神经损伤。结果显微镜下检测到绿色荧光报告蛋白表示感染成功。对感染后的h ADSCs进行免疫组化显色,结果显示WGA已经成功的在h ADSCs中实现了表达,在MCAO小鼠模型脑损伤处追踪到感染了WGA的h ADSCs。结论慢病毒包装WGA蛋白的方法可靠高效,可以作为一种高效的示踪技术广泛应用于各类细胞。

人源性脂肪干细胞对30%体表总面积Ⅲ度烫伤大鼠肺组织炎症反应的影响及其机制初步探讨

目的研究人源性脂肪干细胞(h-ADSCs)对30%体表总面积(TBSA)Ⅲ度烫伤大鼠肺组织炎症反应的作用及机制。方法采用随机数字表法将72只雄性Sprague-Dawley大鼠分为单纯烫伤组和h-ADSCs组,每组各36只。采用沸水水浴法制备30%TBSAⅢ度烫伤模型,烫伤后即刻,h-ADSCs组予尾静脉注射含600万h-ADSCs(总注射量约1 mL),单纯烫伤组予尾静脉注射等体积的等渗NaCl溶液。比较两组大鼠烫伤8 h、1周、2周后肺组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)信使RNA(mRNA)及其蛋白、核因子κB(NF-κB)P65蛋白、苏木素-伊红(HE)染色评分及肺损伤评分,并在普通光镜下观察肺组织病理变化情况。结果h-ADSCs组大鼠烫伤8 h、1周、2周后肺组织TNF-α(t=2.421、2.626、2.356,P=0.035、0.041、0.032)、IL-6(t=2.514、2.751、2.756,P=0.029、0.031、0.039)、HE染色评分(t=2.869、2.631、2.813,P=0.028、0.031、0.042)和肺损伤评分(t=2.172、3.017、2.698,P=0.033、0.032、0.029)和烫伤1周、2周后NF-κB P65蛋白(t=2.639、2.491,P=0.028、0.037)均明显低于单纯烫伤组同时间点;而烫伤1周、2周后α7nAChR mRNA(t=2.912、2.663,P=0.032、0.046)及其蛋白(t=2.814、2.638,P=0.033、0.032)表达水平均明显高于单纯烫伤组同时间点。伤后8 h,h-ADSC组大鼠肺泡隔增宽,间质血管充血,病变轻于单纯烫伤组。伤后1周,h-ADSCs组大鼠镜下可见肺间隔明显增厚,肺泡腔变窄,伴有炎症细胞浸润。伤后2周,h-ADSCs组大鼠镜下可见肺间隔明显增厚,肺泡腔变窄,伴有大量炎症细胞浸润。结论h-ADSCs能减轻30%TBSAⅢ度烫伤休克大鼠肺组织炎症水平,其机制可能与h-ADSCs能增加α7nAChR的表达和抑制肺组织NF-κB P65的表达有关。