人源多能干细胞体外定向诱导分化为肝细胞

目的:探索人源诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在体外二维条件下诱导分化生成肝细胞的条件,并初步探讨三维条件下hiPSCs的肝细胞诱导分化。方法:通过测定4种诱导培养基中白蛋白和甲胎蛋白含量,筛选诱导分化的最佳方案。用筛选出的最优培养基对hiPSCs进行二维培养,采用免疫荧光法、蛋白质印迹法检测诱导后的细胞中肝脏标志蛋白的表达,采用酶联免疫吸附法检测肝细胞功能相关蛋白的含量;对hiPSCs进行三维培养,用酶联免疫吸附法对比二维与三维条件下肝细胞功能,并用HE染色法观察三维条件下形成细胞的形态。结果:二维条件下诱导分化23 d,倒置显微镜下细胞呈典型的肝细胞形态;免疫荧光法、蛋白质印迹法检测到诱导分化后的细胞阳性表达肝脏特征蛋白(甲胎蛋白、白蛋白、角蛋白CK8、角蛋白CK18、SOX17),且与胚胎干细胞来源肝细胞(hESCs-HEPs)内含量相近;酶联免疫吸附法测定结果显示,诱导形成的肝细胞具有正常肝细胞功能,表明hiPSCs已分化为肝细胞;HE染色结果显示三维条件下诱导形成的细胞具有明显双核,呈现典型肝细胞形态;酶联免疫法测定结果显示,三维条件下,诱导形成的肝细胞功能没有受到损伤,仍具有正常肝细胞功能。结论:在二维与三维培养体系下,采用最佳诱导分化方案,hiPSCs能够被诱导分化为肝细胞,且表达肝脏相关蛋白,并具有正常肝细胞功能。

联合调控Wnt和BMP信号通路促进人源诱导多能干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的探讨联合调控Wnt和BMP信号通路在人源诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)分化为心肌细胞中的作用。方法复苏hiPSCs培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态,免疫荧光染色鉴定多能性标记物OCT3/4、NANOG和TRA-1-60表达;传代培养hiPSCs,取35代以内细胞进行后续实验。待细胞融合接近100%时开始分化(记为分化第0天),加入Wnt通路激活剂CHIR99021。于分化第3天加入不同浓度的IWP4(Wnt通路抑制剂),实时荧光定量PCR检测心肌细胞特异性标记物肌钙蛋白T(troponin T,TNNT2)mRNA表达,筛选IWP4最佳浓度;在不同时间点加入最佳浓度IWP4,通过比较TNNT2 mRNA表达筛选最佳作用时间。然后,在加入CHIR99021和IWP4基础上于分化第5天加入不同浓度BMP-4以及不同时间点加入BMP-4,通过检测TNNT2 mRNA表达筛选BMP-4最佳浓度及最佳作用时间。最后,将hiPSCs分为3组,Wnt调控组、BMP调控组和Wnt+BMP联合调控组,在分化第0天加入CHIR99021基础上,分别按照筛选结果加入IWP4、BMP-4、IWP4+BMP-4。收集分化第7、15天细胞,实时荧光定量PCR检测心肌前体细胞标记物ISL1(ISL LIM homeobox 1)、NKX2-5(NK2 homeobox 5)以及心肌细胞特异性标记肌细胞增强因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)、肌球蛋白轻链2(myosin light chain 2,MYL2)、MYL7及TNNT2 mRNA表达;收集分化第28天细胞,流式细胞术及免疫荧光染色检测心肌细胞特异性蛋白心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)表达。结果细胞形态及免疫荧光染色观察显示hiPSCs表达多能性标记物OCT3/4、NANOG和TRA-1-60,提示其具有良好的多能性特点。IWP4促hiPSCs向心肌细胞分化的最佳浓度为10.0μmol/L(P<0.05),最佳作用时间是分化第3天(P<0.05)。BMP-4促hiPSCs向心肌细胞分化的最佳浓度为20.0 ng/mL(P<0.05),最佳作用时间是分化第3天(P<0.05)。Wnt+BMP联合调控组ISL1、NKX2-5以及MEF2C、MYL2、MYL7、TNNT2 mRNA相对表达量,cTnT阳性表达率,以及免疫荧光染色cTnT阳性表达和肌节结构,均优于Wnt调控组,相关定量指标差异均有统计学意义(P<0.05)。结论联合调控Wnt和BMP信号通路可以提高hiPSCs诱导分化为心肌细胞的效率。

人源多能干细胞诱导GABA能神经元移植缓解神经病理性疼痛

神经病理性疼痛给病人带来极大痛苦,且大多数病人对目前的治疗方法都有抵抗。脊髓抑制的减弱是导致神经病理性疼痛的核心因素。已有研究表明胎儿GABA能神经前体细胞可以缓解疼痛,但因其多向分化潜能而不适用于治疗。本研究通过脊髓移植终末分化的人源多能干细胞诱导GABA能神经元(iGABA能神经元),首次证明iGABA能神经元可以显著、长期和安全地缓解小鼠周围神经损伤引起的神经病理性疼痛。此外,移植的iGABA能神经元可以在损伤的脊髓中长期存活并能观察到突触融合。总之,本研究首次为GABA能神经元移植治疗人类神经病理性疼痛提供了有力证据。

脂多糖刺激多能干细胞诱导人源心肌细胞与大鼠心肌细胞的体外模型比较

目的比较脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)对多能干细胞诱导的人源心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPS-CMs)及原代新生大鼠心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的影响。方法不同浓度LPS处理hiPS-CMs和原代新生大鼠CMs 24~48 h,通过实时无标记细胞分析技术(xCELLigence Real-Time Cell Analyser Cardio system RTCA)观察hiPS-CMs和原代新生大鼠CMs的电生理变化;qRT-PCR方法检测NPPB mRNA表达水平和qPCR阵列法检测炎性基因表达水平。结果不同浓度LPS刺激后,原代新生大鼠CMs的电生理变化为搏动频率增加和搏动幅度减少(P<0.01),NPPB mRNA表达水平增加(P<0.01)。在hiPS-CMs中,相对应的LPS浓度刺激未能引起搏动幅度和搏动频率显著变化(P>0.05),NPPB mRNA表达水平未显著增加(P>0.05)。进一步增加浓度(2.5μg/mL~40μg/mL),hiPS-CMs的搏动幅度和搏动频率仍未发生明显变化(P>0.05),NPPB mRNA在高浓度LPS(5μg/mL~40μg/mL)发生差异性改变(P<0.01)。最后,在炎症相关基因表达方面,原代新生大鼠CMs表现为C3、Gpnmb、Atf3、Il6r和Ly96基因水平上调至1.5倍,hiPS-CMs表现为AK4、TOLLIP、SPP1、FABP1、IL6R、LY96和C3基因水平上调至1.5倍。结论与原代新生大鼠CMs相比,hiPS-CMs受到LPS的损伤明显减轻,表现出不同的炎症基因表达模式。

应用hiPSC-ACM和hiPSC-VCM进行药物毒性检测的研究

目的:建立可用于评价药物心脏毒性的人源性诱导多能干细胞分化的心房、心室肌细胞(human induced pluripotent stem cell derived atrial and ventricular cardiomyocytes,hiPSC-ACM、hiPSC-VCM)模型,并采用此模型评价化合物潜在的心脏毒性。方法:通过调控视黄酸(retinoic acid,RA)通路分化出目标细胞,分为RA处理组(RA)和RA抑制剂处理组(RAi),用流式细胞法以及免疫荧光染色法检测心室特异性标志物(MLC2v)和心肌细胞特异性标志物(α-actinin),荧光定量RT-PCR法检测细胞心房、心室基因(MLC2v、MYH7、NR2F2、KCNA5)表达情况,通过细胞活性实验(CCK8)检测已知致心律失常药物特非那定、索他洛尔、伊布利特在不同浓度(0.1、1.0、100.0、1 000.0μmol/L)下对细胞的活性影响,通过钙敏染料Fluo-3 AM检测特非那定(50、100、500 nmol/L)、索他洛尔(1、10、100μmol/L)、伊布利特(0.1、1.0、10.0μmol/L)对于细胞钙瞬变的影响。结果:流式、免疫荧光染色以及荧光定量RT-PCR均显示,心房肌细胞特异性标志物在RA组高表达而在RAi组低表达,心室肌细胞标志物在RA组低表达而在RAi组高表达。RA可以促进hiPSCs向心房肌(ACM)分化,RAi可以促进hiPSCs向心室肌(VCM)分化。特非那定浓度达到较高浓度(100μmol/L)时,两组细胞的活性显著下降,而两组细胞钙瞬变振幅在较低浓度(50 nmol/L)时即出现显著下降。在高浓度索他洛尔(1 mmol/L)的刺激下两组细胞活性显著下降,同样伊布利特的浓度达到1 mmol/L时两组细胞活性均有显著下降。hiPSC-VCM在不同浓度索他洛尔以及伊布利特的刺激下钙瞬变振幅均无显著变化,然而hiPSC-ACM在特非那定1μmol/L及索他洛尔1μmol/L刺激下即开始出现振幅显著下降。结论:人源性诱导多能干细胞可以通过调控视黄酸通道分化的心房、心室肌细胞建立体外心脏毒性评价模型,通过检测其钙瞬变的改变可以迅速、准确地评价药物毒性。

iPCS在药物毒性筛选中的应用

目前对药物毒性的检测系统主要依赖于动物模型和体外细胞培养的体系,不能很好地模拟人体的机体状态,基于人源诱导多能干细胞的体外体系是一个很好的替代方法。本文讨论了人源诱导多能干细胞的制备目前面临的几个问题,主要是诱导和分化率低下、模型制备过程的遗传和表观遗传改变以及难以获得完全成熟表型细胞三个方面的问题,并简单介绍了人源诱导多能干细胞在毒性评估中的几个应用,包括发育毒性评估,药物继发性药理评估及器官特异毒性等方面。

PI3K在舒尼替尼致hiPSC-CMs收缩功能障碍中的作用

目的研究磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)在舒尼替尼致心肌收缩功能障碍中的作用。方法以人源诱导型多能干细胞来源的心肌细胞(hiPSC-CMs)为研究对象,以不同浓度[0(对照)、0.5、1、3、5、10μmol/L]舒尼替尼干预hiPSC-CMs 24 h后,采用CardioExcyte 96系统检测细胞收缩力,并计算半数抑制浓度(IC50);检测舒尼替尼(3.14μmol/L)对细胞收缩频率、钙瞬变幅度、钙瞬变恢复时程以及心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-肌凝蛋白重链(β-MHC)mRNA表达水平的影响;以PI3K的激活剂3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3,1μmol/L)和舒尼替尼共同干预hiPSC-CMs,考察PI3K在舒尼替尼致心肌收缩功能障碍中的作用。结果舒尼替尼对hiPSC-CMs收缩力的抑制作用有浓度依赖趋势,IC50值为3.14μmol/L。以3.14μmol/L舒尼替尼干预后,hiPSC-CMs的收缩频率和钙瞬变幅度均显著降低(P<0.05或P<0.01),钙瞬变恢复时程显著延长(P<0.05),ANP、BNP、β-MHC mRNA表达水平均显著升高(P<0.01);PIP3激活PI3K后,hiPSC-CMs收缩力显著升高(P<0.01)。结论激活PI3K活性是改善舒尼替尼致心肌毒性的潜在分子机制。