基于受体捕获的人源诺如病毒检测方法的优化及应用

在原位捕获反转录实时定量PCR法(In situ capture real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,ISC-RT-qPCR)建立的基础上,本研究旨在优化该新型感染性HuNoVs的检测方法,并将其应用于市售贝类样品中HuNoVs的检测。本研究以2份HuNoVs临床腹泻样本3010(GI组)和3009(GII组)对ISC-RT-qPCR中猪胃粘膜提取物(porcine gastric mucin,PGM)包被浓度、待测样本孵育时间和孵育pH进行了优化;最后,对随机采集的40份市售贝类样品(文蛤、花蛤、海蛏、扇贝和鲍鱼)进行感染性HuNoVs的检测。结果表明,ISC-RT-qPCR最佳试验参数分别为:PGM包被浓度为1.0 mg/mL、待测样本孵育时间为30min、孵育pH(GI组,pH=3.0;GII组,pH=7.0);40份市售贝类样品中,贝类中HuNoVs总检出率为22.5%,多重检出率为5.0%,GI组和GII组HuNoVs的检出率分别为17.5%和10.0%;其中,市售文蛤的GI组和GII组HuNoVs检出率均为最高。因此,ISC-RT-qPCR是一种可用于市售贝类样品中感染性HuNoVs的检测方法,为食品中HuNoVs的检测与监测提供了新选择。

GⅡ.17型诺如病毒人源中和性单链抗体制备及生物特性鉴定

目的:基于一起暴发疫情,构建人源噬菌体单链抗体库,筛选特异性GⅡ.17型诺如病毒(NoV)单链抗体(scFv),并进行表达纯化及鉴定。方法:采集患者粪便或肛拭子样本,RT-PCR检测肠道病毒核酸,PCR扩增NoV衣壳蛋白N/S区和P区序列,Mega 4.0构建系统进化树。采集并分离患者恢复期外周血PBMC,Trizol提取总RNA;RT-PCR扩增抗体重轻链可变区基因,重叠扩增PCR将两者拼接为scFv基因,将其克隆至噬菌粒载体pCANTAB-5E构建人源噬菌体单链抗体库。以GⅡ.17 P颗粒为固相抗原,对抗体库进行筛选及鉴定,将阳性克隆进行原核表达及纯化,ELISA鉴定其生物特性。结果:此次疫情中,83.3%(15/18)粪便或肛拭子样本呈GⅡ型NoV核酸阳性,经序列比对分析确定由GⅡ.17型感染导致;成功构建人源噬菌体单链抗体库,以GⅡ.17 P颗粒为抗原筛选得到11株序列不同且正确的阳性克隆;经原核表达获得9株与GⅡ.17 P颗粒具有良好亲和力的高纯度scFv,且与GⅡ.4和GI.3 P颗粒均有较好的特异性交叉反应,其中7株具有较强阻断GⅡ.17 P颗粒与HBGA受体结合的能力。结论:此次疫情为一次GⅡ.17型NoV引发的急性胃肠炎暴发,构建了人源噬菌体抗体库,经淘筛及表达纯化,最终获得9株GⅡ.17型NoV单链抗体,其中7株具有较强的中和能力。

我国贝类中人源诺如病毒检出状况的荟萃分析

人源诺如病毒(Human Noroviruses,HuNoVs)是引发食品安全事件的重要病原微生物。贝类为滤食性动物,是HuNoVs污染传播的重要媒介。本研究搜集了我国贝类污染调查的横断面研究文献,综合评价了贝类中HuNoVs的污染现状。通过检索中国知网、维普、万方、中国生物医学文献数据库、PubMed和EMbase数据库,从所获得的600篇关于贝类污染HuNoVs相关文献中筛选纳入37篇。采用Stata 14.0软件进行荟萃分析,结果显示,我国贝类中不同基因型HuNoVs的混合检出率达15%(95%CI:11%~18%)。亚组分析显示,GⅡ基因群检出率(11%)高于GⅠ基因群(4%);地理位置对贝类中病毒污染水平影响显著(P<0.01),华南地区、华北地区、华东地区的检出率分别达到19%、17%和11%,而东北和西北地区则分别为4%和9%;此外,季节差异明显,其中,冬季的病毒检出率最高(25%),而夏季仅为10%,春季、秋季则分别为16%和12%;不同品种贝类的病毒污染同样存在差异,其中,牡蛎(Ostreidae)(16%)、贻贝(Mytilusedulis)(10%)和蛤(Mactridae)(9%)中病毒检出率居前三。综上所述,我国贝类中HuNoVs污染较为普遍,地区、季节、贝类品种等因素均对病毒污染存在显著影响。本研究结果有助于综合掌握我国贝类中食源性病毒污染现状,为精准防控食源性HuNoVs传播提供研判依据,促进贝类产业的高质量发展。

蜂胶提取物对诺如病毒的体外抑制作用研究

为研究蜂胶提取物对人源诺如病毒的体外抑制作用,采用小鼠诺如病毒和噬菌体MS2病毒为替代病毒,研究蜂胶水提物和醇提物随浓度及时间变化对小鼠诺如病毒和噬菌体MS2病毒的抑制作用及其机制。浓度相关性实验表明:随着蜂胶醇提物浓度增加,小鼠诺如病毒和MS2病毒滴度呈显著下降趋势,当醇提物质量浓度达到500μg/mL时,小鼠诺如病毒和MS2病毒滴度分别下降了6.93 lgPFU/mL和3.75 lgPFU/mL。时间相关性实验表明:将质量浓度为250μg/mL蜂胶醇提物与小鼠诺如病毒和MS2病毒培养60 min,前40 min小鼠诺如病毒和MS2病毒滴度分别下降4.18 lgPFU/mL和3.30 lgPFU/mL,随后下降趋势减缓,在60 min时,小鼠诺如病毒和MS2病毒的总滴度分别下降了4.48 lgPFU/mL和3.67 lgPFU/mL。机制研究表明:蜂胶醇提物可能与宿主细胞(受体)结合,或直接与病毒颗粒结合,使病毒衣壳蛋白变性,阻止病毒进入宿主细胞;透射电镜图像进一步证实了蜂胶醇提物直接作用病毒导致其膨胀破裂。最后,经蜂胶醇提物处理后,人为污染病毒的蔬菜汁和果汁中病毒的滴度显著降低。研究结果将有可能为果蔬在鲜榨过程中,挑选合适的添加剂提供更多的选择。

细菌细胞表面展示体系提呈人源诺如病毒(GⅡ.4)抗原效果的评价

人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是重要的肠胃炎病毒之一,造成了全球巨额经济负担,故其防控成为研究热点。探究不同形式的免疫原对机体体液和粘膜免疫的激发效果,成为HuNoVs疫苗研发的一个突破口。本研究利用前期以细菌细胞表面展示体系构建的假HuNoVs(GⅡ.4)和纯化的P(GⅡ.4)蛋白为对象,乳化后每隔两周分别进行Balb/C小鼠皮下多点和口服免疫,并以间接酶联免疫吸附试验测定血清中抗体的消长规律。同时,以磷酸盐缓冲液作为对照。抗体效价测定结果显示:皮下免疫组的假HuNoVs(GⅡ.4)可以有效激发小鼠体液免疫,其效价稍低于以P(GⅡ.4)蛋白作为抗原免疫获得的抗体。经过5次免疫后,血清中IgG抗体效价基本趋于稳定。但是,假HuNoVs(GⅡ.4)和P(GⅡ.4)蛋白的口服免疫组血清中均未测到IgA和IgG抗体。因此,细菌细胞表面展示体系假HuNoVs(GⅡ.4)可以作为HuNoVs疫苗候选抗原的提呈体系,为该病毒的疫苗研发提供借鉴。

牡蛎热休克蛋白70吸附人源诺如病毒功能域的解析

人源诺如病毒(Human norovirus,HuNoV)是全球范围内最重要的食源性病毒之一,牡蛎是其主要的食源性传播载体。已有研究发现:牡蛎热休克蛋白70(oyster Heat shock protein 70,oHSP70)可吸附不同基因型HuNoV,但oHSP70吸附病毒的功能域不清楚。本研究对oHSP70的N端和C端分别进行克隆表达纯化,并采用ELISA方法测定其与不同基因型HuNoV主要衣壳蛋白P功能域的结合能力。实验结果表明:成功获得N端和C端oHSP70的原核表达产物;N端oHSP70与不同基因型HuNoV P蛋白结合能力显著强于C端(P<0.05)。因此,N端oHSP70是结合HuNoV P蛋白的主要结构域。本研究结果为进一步揭示oHSP70与HuNoV互作的分子机制提供了理论支撑。

人源诺如病毒GII.3[P12]型病毒样颗粒的免疫原性及受体结合能力

目的制备GII.3[P12]型人源诺如病毒(human norovirus,HuNoV)广州株GZ2013-L20的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)和多克隆抗体,系统表征其免疫原性特征和受体结合能力,为HuNoV防控提供数据支撑。方法以GZ2013-L20毒株基因组为模板,扩增ORF2并构建重组转座载体,转化至大肠埃希菌DH10Bac获得重组杆状病毒质粒Bacmid-L20-ORF2,在昆虫细胞sf9中表达目的VLP,采用透射电镜、SDS-PAGE、Western blot(WB)和受体结合实验等方法对纯化后VLP进行鉴定。此外,将VLP免疫小鼠获得多克隆抗体,通过间接ELISA和受体结合阻断试验进行评价。结果构建了重组杆状病毒Bacmid-L20-ORF2,并成功获得目的毒株VLP;透射电镜显示颗粒直径约为30 nm;SDS-PAGE和WB结果显示蛋白相对分子质量(Mr.×10^(3))约58;受体结合实验表明,目的VLP与分泌型唾液受体(A型、B型、AB型和O型)、O型非分泌型唾液受体以及猪胃黏蛋白均能有效结合;VLP多克隆抗体效价达到2×10^(5),且与20种(20/28)基因型HuNoV的衣壳蛋白具有交叉免疫反应;受体结合阻断实验显示,多克隆抗体仅对同型VLP具有中和阻断效果,而对GII.2、GII.4、GII.8和GII.17等基因型VLP没有中和作用。结论GII.3[P12]型HuNoV广州株VLP与分泌型和非分泌型唾液受体均呈现较强的结合能力,其多克隆抗体具有免疫结合广谱性,但中和阻断效果仅对同型病毒有效,其结果为疫苗研发的理性设计提供基础数据。

基于GII.4型诺如病毒P蛋白的GII型广谱单克隆抗体制备及应用

人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是全球引起急性胃肠炎的重要传染病原。该病毒遗传多样性丰富,包括了5个基因群以及39种基因型,免疫学检测受限。因此,本研究旨在制备广谱性的HuNoV单克隆抗体,并建立可检测多种基因型的双抗体夹心ELISA方法。本研究通过表达纯化流行毒株GII.4型HuNoVs衣壳蛋白P颗粒免疫Balb/c小鼠,筛选出3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体并进行评价。利用辣根过氧化物酶对抗体进行标记及配对筛选,建立了HuNoVs双抗夹心ELISA检测方法,并进行验证。结果显示:B10、1D6、1C1细胞株可分泌广谱性单克隆抗体。所建立的双抗夹心ELISA方法酶标抗体最佳工作浓度为1∶5 000,捕获抗体最佳包被浓度为2.0μg/mL,该方法检测GII.4型P颗粒最低检出限为125.0ng/mL,对常见HuNoVs GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.17基因型样本均能检出,而与轮状病毒、星状病毒、肠道病毒、札幌病毒无交叉反应。批间与批内重复变异系数均小于7%。临床样本检测结果显示,本方法与荧光定量RT-PCR结果的符合率为84%。本研究成功制备了广谱性的HuNoVs衣壳蛋白单克隆抗体,建立了可应用于HuNoVs流行毒株基因型的双抗夹心ELISA检测方法,为HuNoVs的诊断及流行病学调查提供了一种简便、特异的免疫学方法。