PDLSCs-Exo对炎性环境中牙周膜干细胞增殖能力及活性氧水平的影响

目的探讨牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)来源的外泌体(exosome,Exo)对炎性环境中牙周膜干细胞增殖及活性氧水平的影响。方法分离培养牙周膜干细胞,提取牙周膜干细胞来源的外泌体,并将其添加至正常及含有10μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的牙周膜干细胞培养基中,实验对象分为PDLSCs组、PDLSCs+LPS组、PDLSCs+Exo组、PDLSCs+LPS+Exo组,检测各组牙周膜干细胞对外泌体的摄取能力、增殖能力、细胞内活性氧水平及炎性因子水平。结果在10μg/m L LPS刺激下,牙周膜干细胞增殖能力下降。组间对比,PDLSCs+LPS组较PDLSCs组、PDLSCs+Exo组、PDLSCs+LPS+Exo组增殖能力显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);PDLSCs+LPS+Exo组增殖能力较PDLSCs+Exo组降低,差异有统计学意义(P<0.05);细胞内活性氧及炎性因子对比,PDLSCs+LPS组较其余三组细胞内活性氧水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论牙周膜干细胞来源的外泌体能够改善LPS刺激导致的牙周膜干细胞增殖活性降低,降低胞内活性氧及炎性因子水平,并提高牙周膜干细胞的抗氧化能力。

补骨脂素对人牙周膜干细胞增殖、成骨分化的促进作用及其机制

目的观察补骨脂素对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)增殖、成骨分化的促进作用,并探讨其机制。方法将第三代hPDLSCs分为6组,5、10、25、50、100μmol/L补骨脂素组加入5、10、25、50、100μmol/L补骨脂素,对照组正常培养,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,比色法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色检测成骨诱导矿化结节。另取第三代hPDLSCs并分为两组,25μmol/L补骨脂素组加入25μmol/L补骨脂素,对照组正常培养,采用RT-PCR法检测转录因子2(Runx2)、骨桥蛋白(OPN)mRNA。结果与对照组比较,5、10、25、50、100μmol/L补骨脂素组细胞增殖能力和ALP活性增加,25μmol/L补骨脂素组细胞成骨矿化结节增加(P均<0.05);与5μmol/L补骨脂素组比较,25、50、100μmol/L补骨脂素组细胞增殖能力及10、25μmol/L补骨脂素组细胞ALP活性和25μmol/L补骨脂素组细胞成骨矿化结节增加(P均<0.05);与10μmol/L补骨脂素组比较,25、50、100μmol/L补骨脂素组细胞增殖能力增加(P均<0.05);与25μmol/L补骨脂素组比较,50、100μmol/L补骨脂素组细胞ALP活性降低(P均<0.05)。与对照组比较,25μmol/L补骨脂素组Runx2、OPN mRNA相对表达量增加(P均<0.05)。结论5~100μmol/L补骨脂素均能促进hPDLSCs的增殖和成骨分化,在5~25μmol/L呈剂量依赖性增强,在50~100μmol/L变化不明显;补骨脂素促进hPDLSCs的增殖和成骨分化的机制可能与调节Runx2信号通路有关。

培养模式控制对人牙周膜和骨髓间充质干细胞生物电特性的影响

目的:探索微模式培养控制和导电基底对人牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞生物电特性的影响。方法:通过光刻技术在盖玻片和导电玻璃两种透明材料表面构造与细胞自身宽度相当的微模式化培养基底,微模式图案分为两种:单种细胞的单格阵列结构、双细胞共培养的交叉指贯通结构。应用全细胞膜片钳技术记录两种细胞在不同培养模式下的静息电位、钾通道电流等生物电特性。实验分9组:培养皿对照组、盖玻片牙周膜干细胞组、盖玻片骨髓间充质干细胞组、盖玻片共培养牙周膜干细胞组、盖玻片共培养骨髓间充质干细胞组、导电玻璃牙周膜干细胞组、导电玻璃骨髓间充质干细胞组、导电玻璃共培养牙周膜干细胞组、导电玻璃共培养骨髓间充质干细胞组。结果:对于牙周膜干细胞,与对照组自由铺展培养模式相比,微模式化形态控制导致细胞膜电容减小,钾通道电流密度增大(P<0.01),导电基底导致细胞静息膜电位绝对值增大;两种微模式化培养模式相比,双细胞交叉指贯通培养使得细胞静息膜电位绝对值减小。对于骨髓间充质干细胞,与对照组自由铺展培养模式相比,导电基底表面细胞膜电容增大、钾通道电流密度减小和静息膜电位绝对值减小,但双细胞交叉指贯通培养则导致细胞膜电容减小、钾电流密度增大和静息膜电位绝对值增大;与盖玻片共培养模式相比,导电玻璃共培养细胞的钾电流密度显著增大(P<0.01)。结论:导电培养微模式能够调控人牙周膜和骨髓间充质干细胞的生物电特性,从利用内源电场角度,为深入探索两种干细胞促进口腔软硬组织再生修复机制提供新的思路。

南蛇藤素对脂多糖诱导的人牙周膜干细胞增殖、凋亡和炎症反应的影响

目的 探讨南蛇藤素(Cel)对微小RNA(miR)-223-3p/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)轴对脂多糖(LPS)诱导的人牙周膜干细胞(hPDLSCs)增殖、凋亡和炎症反应的影响。方法 分别给予不同浓度的Cel(1、2、4μmol/L)培养经1μg/ml LPS诱导的hPDLSCs,以未处理的hPDLSCs作为对照组。采用MTT法检测细胞存活率,选取合适的Cel浓度用于后续实验研究。将对数生长期hPDLSCs分为对照组、LPS组、Cel组(2μmol/L),采用LipofectamineTM2000转染试剂盒在Cel组的基础上转染细胞miR-223-3p inhibitor及阴性对照(inhibitor NC),并命名为Cel+inhibitor NC组、Cel+miR-223-3p inhibitor组。分别检测以上各组细胞凋亡、增殖以及炎症因水平;q RT-PCR检测各组细胞中miR-223-3p表达水平,Western blot检测细胞中NLRP3蛋白及凋亡蛋白-天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)表达;双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-223-3p、NLRP3靶向关系。结果 2μmol/L Cel作用细胞后其活力最高。与对照组相比,LPS组细胞存活率、mi R-223-3p表达显著下降,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6含量、细胞凋亡率、NLRP3、Caspase-1表达显著升高(P<0.05);与LPS组相比,Cel组细胞存活率、miR-223-3p表达显著升高,TNF-α、IL-1β、IL-6含量、细胞凋亡率、NLRP3、Caspase-1表达显著降低(P<0.05);与Cel+inhibitor NC组相比,Cel+miR-223-3p inhibitor组LPS组细胞存活率、miR-223-3p表达显著下降,TNF-α、IL-1β、IL-6含量、细胞凋亡率、NLRP3、Caspase-1表达显著升高(P<0.05)。结论 Cel可以促进LPS诱导的hPDLSCs增殖,抑制细胞凋亡及炎症反应,可能与上调miR-223-3p、抑制NLRP3表达有关。

ROS/JNK/caspase 3信号轴在薄荷味电子烟烟液诱导牙周膜干细胞凋亡中的作用

目的:探讨薄荷味电子烟暴露对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)的细胞毒性及促凋亡机制。方法:自正畸拔除的健康前磨牙的牙周膜中分离、培养得到PDLSCs,取第3代细胞,流式细胞术分析表面干细胞标志物。将薄荷味电子烟烟液(尼古丁浓度为59 mg/mL)加入细胞培养基,使各暴露剂量组细胞培养基中的尼古丁终浓度分别为0.1μg/mL、1.0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL,0.1 mg/mL、0.2 mg/mL和0.5 mg/mL,于不同时间点(24、48、72 h)检测各组细胞的细胞活力(CCK8法)及细胞凋亡情况(7-AAD及Annexin V双染后流式细胞术分析、TUNNEL分析)。采用荧光探针DCFH-DA检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,共聚焦显微镜下观察及流式细胞分析。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)分析ROS/JNK/caspase 3信号轴相关蛋白[c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)、c-Jun、磷酸化c-Jun(p-Jun)、Bcl-2、Bax和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase 3)]的表达水平,采用免疫荧光染色分析p-JNK的表达。分别添加ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(Nacetyl-l-cysteine, NAC)及MAPK/JNK特异性阻断剂SP600125预处理细胞,分析其对电子烟诱导的细胞凋亡的影响。采用Graph Pad 5.0软件包对数据进行统计学分析。结果:成功分离、培养出hPDLSCs,流式细胞术分析显示间充质干细胞表面标志分子CD29、CD90、CD105及CD146表达阳性。各电子烟暴露剂量组3个时间点(24、48、72 h)细胞活力情况相比,差异有统计学意义(P<0.001);各浓度组细胞凋亡情况相比,差异有统计学意义(P<0.001)。与0.0 mg/L浓度对照组相比,≥50μg/mL暴露剂量组呈浓度依赖性方式显著抑制细胞活力,促进细胞凋亡比例增加,并且上调细胞ROS水平。Western印迹分析提示,电子烟暴露可浓度依赖并以时间依赖激活MAPK/JNK磷酸化,NAC及SP60025预处理能反转电子烟暴露导致的上调的p-JNK及活化型caspase 3水平,降低电子烟暴露诱导的PDLSCs凋亡率。结论:ROS/JNK/caspase 3信号轴参与薄荷味电子烟暴露诱导的PDLSCs细胞凋亡。

机械力作用下牙周膜干细胞调控骨重塑的研究进展

力诱导的牙周组织重塑在口腔稳态调控中具有重要意义。牙周膜为正畸牙移动(OTM)过程提供微环境支持,而牙周膜干细胞(PDLSC)作为重要的间充质干细胞,在调控牙周组织重塑中发挥重要作用。本文综述了机械力刺激下PDLSC调控骨重塑的研究进展,指出PDLSC可通过多种途径感知机械力刺激,是具有多向分化能力及免疫调节作用的间充质干细胞。PDLSC通过调控骨骼系统细胞,如成骨细胞、破骨细胞及骨细胞的活动调节骨重塑,还可通过调控免疫系统活动间接影响骨重塑。本文总结了PDLSC在OTM骨重塑中的功能作用,为进一步探索机械力调控骨重塑的机制提供了基础。

炎症与正常牙周膜来源牙周膜干细胞的成骨分化能力和自噬水平

背景:炎症影响牙周膜干细胞的成骨分化,同时牙周膜干细胞的成骨能力与自噬水平密切相关,但是炎症是否影响牙周膜干细胞成骨分化不同阶段的成骨能力与自噬水平尚未见相关报道。目的:探讨牙周膜干细胞在牙周炎和正常状态下的碱性磷酸酶表达和自噬水平。方法:分离培养健康人群与牙周炎患者的牙周膜干细胞,进行Vimentin、pan-CK和Stro-1荧光染色。正常和炎症牙周膜干细胞成骨分化3,7,14d时,Westernblot检测碱性磷酸酶、LC3B、Beclin1、ATG5的蛋白表达,real-time PCR检测碱性磷酸酶、骨唾液蛋白、骨钙素、Runx2、LC3B、Beclin1、ATG5的mRNA表达。结果与结论:(1)牙周膜干细胞内Stro-1阳性表达,Vimentin阳性表达,pan-CK阴性表达;(2)成骨分化3,7,14 d,与正常牙周膜干细胞相比,炎症牙周膜干细胞所形成的矿化结节明显减少(P<0.01),碱性磷酸酶的蛋白和mRNA表达明显降低(P<0.05),骨唾液蛋白、骨钙素、Runx2的mRNA表达明显降低(P<0.05);(3)成骨分化7,14 d,与正常牙周膜干细胞相比,炎症牙周膜干细胞的ATG5、LC3B与Beclin1蛋白和mRNA表达均明显降低(P<0.05)。结果表明,炎症可减少牙周膜干细胞的矿化结节形成和碱性磷酸酶的表达,削弱牙周膜干细胞成骨分化7,14 d的自噬潜能。

模拟炎症微环境下紫草素对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的探究紫草素在牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的炎症微环境下对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响。方法从健康人牙周膜组织中分离培养人牙周膜干细胞,采用流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD29、CD105、CD34、CD45。CCK-8法检测不同浓度紫草素对正常及模拟炎症微环境下人牙周膜干细胞增殖活性的影响:首先筛选出紫草素促进增殖人牙周膜干细胞作用的适宜浓度范围,再取牙周膜干细胞进行后续实验分组:空白组(单纯培养基)、紫草素组(实验药物浓度紫草素)、LPS组(牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,P.g-LPS,10μg/mL)、紫草素+LPS组(实验药物浓度紫草素+P.g-LPS)。3 d时采用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中IL-6、IL-18水平;7 d时进行碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性测试、21 d时进行茜素红染色检测成骨的分化能力;168 h时进行RT-PCR检测骨钙素、RUNT相关转录因子2、碱性磷酸酶等成骨基因的表达。结果分离培养的人牙周膜干细胞主要呈束状长梭形,流式鉴定结果表面标志物CD29(99.91%)、CD105(92.34%)、CD34(0.76%)、CD45(0.32%),证实分离细胞符合干细胞特性。CCK-8检测结果显示:正常状态下,与空白组相比,紫草素0.0625、0.125、0.25、0.5μmol/L组人牙周膜干细胞相对细胞活力升高(P<0.05);模拟炎症环境下,紫草素0.5μmol/L组人牙周膜干细胞活性最好(P<0.05)。同时与LPS组相比,0.5μmol/L浓度的紫草素可促进炎症状态下细胞迁移,降低炎症状态下IL-6、IL-18的水平(P<0.05),对炎症状态下人牙周膜干细胞成骨分化作用明显,可以增强炎症状态下骨钙素、RUNT相关转录因子2、碱性磷酸酶等成骨基因的表达(P<0.05)。结论模拟炎症微环境下,适当浓度的紫草素可降低炎症环境下IL-6、IL-18水平,同时具有一定促进人牙周膜干细胞增殖、迁移和成骨分化的作用,可作为慢性牙周炎防治的潜在备选药物。

氧化苦参碱对牙周膜干细胞干性标志物表达和成骨分化的作用

背景:人牙周膜干细胞是牙周再生组织工程潜在的功能细胞,然而长期体外培养会导致牙周膜干细胞干性减低并发生复制性衰老,从而影响其治疗效果。目的:探讨氧化苦参碱在体外对牙周膜干细胞干性维持和骨向分化的影响,并寻找潜在的影响机制。方法:采用组织块酶消化法从人牙周膜组织中分离、培养得到牙周膜干细胞,并使用流式细胞仪进行间充质细胞表面标志物鉴定。用0,2.5,5,10μg/mL氧化苦参碱孵育牙周膜干细胞,通过CCK8实验检测氧化苦参碱对牙周膜干细胞增殖活性的影响,筛选后续实验合适的药物质量浓度,采用Western blot检测牙周膜干细胞中干细胞非特异性蛋白SOX2和OCT4的表达,采用qRT-PCR、Western blot检测牙周膜干细胞中成骨相关基因和蛋白表达水平。结果与结论:①CCK8实验结果显示2.5μg/mL氧化苦参碱对牙周膜干细胞增殖活性有显著增强作用,后续实验选用2.5μg/mL氧化苦参碱进行干预;②与空白对照组相比,氧化苦参碱组牙周膜干细胞的干性标志物SOX2蛋白表达水平变化不明显(P>0.05),OCT4蛋白表达明显上调(P<0.05);③与成骨诱导组相比,氧化苦参碱+成骨诱导组牙周膜干细胞成骨相关基因ALP、RUNX2 mRNA表达及成骨相关蛋白ALP蛋白表达明显下调(P<0.05);④氧化苦参碱上调牙周膜干细胞干性标志物表达,抑制牙周膜干细胞骨向分化,高通量测序结果表明可能与WNT2、WNT16、COMP、BMP6有关。

miR-149-3p靶向调节Akt1介导牙周膜干细胞成骨分化的作用机制研究

目的探讨miR-149-3p靶向调节蛋白激酶B(protein kinase B,Akt1)介导牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化的作用及机制。方法选取2022-01月在作者医院口腔科就诊的18~25岁患者因正畸而拔除的前磨牙或第三磨牙,分离牙周膜组织,提取人PDLSCs。免疫组织化学染色法检测角蛋白(pan-cytokeratin)和波形蛋白(vimentin)鉴定人PDLSCs。将人PDLSCs分为对照组、空载组、miR-149-3p inhibitor组和miR-149-3p mimic组。对照组人PDLSCs不进行处理,空载组、miR-149-3p inhibitor组和miR-149-3p mimic组按Lipofectamine 3000说明书方法分别将空载质粒和miR-149-3p inhibitor、miR-149-3p mimic转染到人PDLSCs。实时荧光逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测细胞内miR-149-3p、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、Akt1 mRNA表达;Western blot检测细胞内ALP、Runx2、Akt1蛋白表达。采用Fluo-3 AM探针检测细胞内钙离子。结果免疫组织化学结果显示,人PDLSCs二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)染色vimentin呈阳性,pan-cytokeratin呈阴性,提示PDLSCs提取成功。与对照组和空载组相比,miR-149-3p inhibitor组miR-149-3p表达显著降低,ALP、Runx2、Akt1 mRNA和蛋白表达、细胞内钙离子荧光强度均显著升高(P均<0.05);miR-149-3p mimic组miR-149-3p表达显著升高,ALP、Runx2、Akt1 mRNA和蛋白表达、细胞内钙离子荧光强度均显著降低(P均<0.05)。与miR-149-3p inhibitor组相比,miR-149-3p mimic组miR-149-3p表达显著升高,ALP、Runx2、Akt1 mRNA和蛋白表达、细胞内钙离子荧光强度均显著降低(P均<0.05)。对照组与空载组各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论过表达miR-149-3p可靶向抑制Akt1蛋白的表达,从而抑制成骨标志物ALP和Runx2表达,降低人PDLSCs内钙离子浓度,不利于人PDLSCs成骨分化。

包裹牙周膜干细胞和二甲双胍的磷酸钙-微纤维支架用于骨缺损的修复及机制研究

目的目前针对牙槽骨不规则缺损的修复尚无行之有效的治疗手段。制备一种包裹牙周膜干细胞和二甲双胍的磷酸钙(CPC)-微纤维(aMF)支架,评价其理化性能以及体外成骨效果,并分析其用于临床进行骨缺损修复的可能性。方法将磷酸四钙与无水碳酸氢钙混合制备磷酸钙骨水泥,将藻酸钠在7.5%的氧化条件下降解,将上述支架材料混合后,包裹牙周膜干细胞和二甲双胍,制备出CPC-aMF骨缺损修复支架。通过扫描电镜以及光学显微镜,对该支架进行初步理化性能和表面形貌的表征。最后通过碱性磷酸酶等成骨分化实验确定该支架的成骨效果。结果在该支架的表面形貌表征中发现,CPC提供了支撑结构,aMF作为其内包裹的细胞和生长因子保护。这种新型支架显示了良好的成骨性能,碱性磷酸酶半定量检测发现包裹牙周膜干细胞和二甲双胍的CPC-aMF支架的成骨效果是对照组的2.5倍,qT-PCR检测结果发现实验组的成骨效果是对照组的2.5倍。结论新型的骨缺损支架为治疗大面积骨缺损提供了一种潜在的治疗性骨组织工程策略。

巨噬细胞极化对牙周膜干细胞增殖、迁移、成骨分化的影响

目的 探究不同极化类型巨噬细胞(Mφs)对牙周膜干细胞(PDLSCs)增殖、迁移、成骨分化的影响。方法 组织块法分离培养PDLSCs;刺激人髓系白血病单核细胞(THP-1)活化为未分化的Mφs (M0)型后诱导极化为Ⅰ型Mφs(M1)和Ⅱ型Mφs(M2),实时荧光定量PCR (qPCR)检测炎性因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10和转化生长因子-β(TGF-β)的mRNA表达水平;收集不同极化类型Mφs的培养上清液后刺激PDLSCs,对照(NC)组不添加Mφs的培养上清液,噻唑蓝(MTT)法检测对PDLSCs增殖的影响,划痕实验检测对PDLSCs迁移的影响,Western blot检测Runt相关转录因子2(RUNX2)和碱性磷酸酶(ALP)蛋白表达以及茜素红染色探究PDLSCs钙化结节沉积。结果 qPCR显示M1型Mφs中TNF-α、IL-1β和IL-6表达量较M0和M2型Mφs升高(P<0.05),M2型Mφs中IL-10和TGF-β表达量较M0和M1型Mφs升高(P<0.05);Western blot显示,与NC组相比,M0和M2组PDLSCs中RUNX2和ALP蛋白表达升高(P<0.05);茜素红染色显示,相较于NC组,M0、M1和M2组PDLSCs中钙化结节沉积增多;MTT结果表明M0和M1组PDLSCs的增殖较NC组受抑制(P<0.05);划痕实验显示M1和M2组PDLSCs迁移能力强于NC组。结论 M0和M1型Mφs抑制PDLSCs增殖,M1和M2型Mφs促进PDLSCs迁移,不同类型的Mφs均促进PDLSCs成骨分化。

圣草酚调节YAP/TAZ信号通路对牙周炎牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探究圣草酚调节Yes相关蛋白(YAP)/转录共激活因子(TAZ)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的牙周膜干细胞(hPDLSC)成骨分化的影响。方法:采用结扎法进行大鼠牙周炎造模,造模成功后随机分为模型组和圣草酚组,每组6只,另取6只正常大鼠作为对照组。体外培养hPDLSC,以10μg/mL的LPS诱导的同时采用0、40、80、160、320、480μmoL/L的圣草酚处理,采用试剂盒检测各处理组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性后筛选圣草酚最佳作用浓度。将hPDLSC随机分为对照组、LPS组、LPS+圣草酚组、LPS+空载组、LPS+圣草酚+YAP敲低组,诱导其成骨分化并以LPS、圣草酚和质粒分组处理。采用HE染色观察牙周组织病理形态学变化;采用实时荧光定量PCR与免疫印迹实验检测各组牙周组织及细胞YAP、TAZ表达;采用ALP活性检测试剂盒、ALP染色及茜素红染色检测各组细胞成骨分化;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组血清及细胞炎症因子前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素(IL)-6、IL-18水平;采用实时荧光定量PCR与免疫印迹实验检测各组牙周组织细胞成骨分化因子Runx2、OSX、骨桥蛋白(OPN)表达。结果:与对照组比较,模型组大鼠牙周组织呈现明显的病理损伤,血清PGE2、IL-6及与IL-18水平增高,牙周组织YAP、TAZ mRNA与蛋白表达降低(P<0.05);与模型组相比,圣草酚组大鼠牙周组织病理损伤减轻,血清PGE2、IL-6及与IL-18水平下降,牙周组织YAP、TAZ mRNA与蛋白表达增高(P<0.05)。40、80、160、320、480μmoL/L的圣草酚均可升高LPS诱导的hPDLSC中ALP活性(P<0.05),其升高作用随着圣草酚浓度升高而增强并在320μmoL/L时达到平台期,故选择320μmoL/L的圣草酚进行后续实验。与对照组相比,LPS组细胞YAP、TAZ mRNA与蛋白表达、ALP阳性相对比例、ALP活性、矿化结节相对比例、Runx2及OSX、OPN mRNA与蛋白表达降低(P<0.05),PGE2、IL-6及与IL-18水平升高(P<0.05)。与LPS组相比,LPS+圣草酚组细胞YAP、TAZ mRNA与蛋白表达、ALP阳性相对比例、ALP活性、矿化结节相对比例、Runx2及OSX、OPN mRNA与蛋白表达升高(P<0.05),PGE2、IL-6及与IL-18水平降低(P<0.05);LPS+空载组细胞各指标无明显变化(P>0.05)。与LPS+圣草酚组相比,LPS+圣草酚+YAP敲低组细胞YAP、TAZ mRNA与蛋白表达、ALP阳性相对比例、ALP活性、矿化结节相对比例、Runx2及OSX、OPN mRNA与蛋白表达降低(P<0.05),PGE2、IL-6及与IL-18水平升高(P<0.05)。结论:圣草酚可减轻牙周炎大鼠的炎症损伤,并通过上调YAP/TAZ通路蛋白表达抑制LPS诱导的hPDLSC炎症,从而促使其成骨分化。

牙周膜干细胞免疫调节特性的研究进展

牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)具有多向分化的潜能,是牙周组织再生的首选种子细胞。近年来,大量研究证实PDLSCs还具有广泛的免疫调节特性,深入探究其具体分子机制对于牙周炎的治疗具有重要的指导意义。本文旨在归纳总结PDLSCs对各种免疫细胞的调控以及炎症环境对PDLSCs免疫特性影响的研究进展,以期为实现PDLSCs的异体移植提供重要理论依据,从而提升牙周组织再生的治疗效果。现有研究表明,PDLSCs对固有免疫细胞和获得性免疫细胞均具有一定的免疫抑制作用,炎症刺激可导致其免疫调节特性受损。然而,目前的研究主要局限于体外细胞试验,缺乏对体内环境下PDLSCs免疫调节作用的深入研究,基于细胞谱系示踪和条件性基因敲除技术的体内研究可能成为未来的主要研究方向。

成骨诱导人牙周膜干细胞来源外泌体促进炎症微环境下人牙周膜干细胞成骨分化

背景:成骨诱导间充质干细胞来源外泌体具有较强的成骨分化能力,但是在炎症微环境下对人牙周膜干细胞成骨分化的影响尚不明确。目的:探究成骨诱导人牙周膜干细胞来源外泌体在炎症微环境下对人牙周膜干细胞成骨分化的影响。方法:收集离体牙并分离培养人牙周膜干细胞,成骨诱导3 d后提取外泌体。将人牙周膜干细胞分为4组:对照组加入成骨诱导培养基,外泌体组加入含5μg/mL外泌体的成骨诱导培养基,炎症模型和炎症模型+外泌体组以1μg/mL脂多糖处理24 h构建细胞炎症微环境,炎症模型组在脂多糖处理后加入成骨诱导培养基,炎症模型+外泌体组在脂多糖处理后加入含5μg/mL外泌体的成骨诱导培养基。通过茜素红以及碱性磷酸酶染色法检测各组人牙周膜干细胞的成骨分化能力;实时荧光定量PCR与免疫印迹法检测各组人牙周膜干细胞中Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)和wnt通路相关蛋白β-catenin的表达。结果与结论:(1)与对照组相比,炎症模型组碱性磷酸酶染色相对面积、矿化结节染色相对面积以及Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、OSX的表达量显著降低(P <0.05);(2)与炎症模型组相比,炎症模型+外泌体组碱性磷酸酶染色相对面积、矿化结节染色相对面积以及Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、OSX的表达显著升高(P <0.05);(3)与对照组相比,炎症模型组wnt通路相关蛋白β-catenin表达量显著增加(P <0.05);与炎症模型组相比,炎症模型+外泌体组β-catenin表达量显著降低(P <0.05)。结果表明,成骨诱导人牙周膜干细胞来源外泌体可促进炎症微环境下人牙周膜干细胞的成骨分化,其作用机制可能与wnt/β-catenin信号通路有关。

西格列汀激活基质细胞衍生因子-1/CXC趋化因子受体4信号通路对脂多糖诱导的人牙周膜干细胞增殖、凋亡、炎症和成骨分化的影响

目的 探讨西格列汀对脂多糖(LPS)诱导的炎症微环境下人牙周膜干细胞(hPDLSCs)增殖、凋亡、炎症和成骨分化的影响及分子机制。方法 体外培养hPDLSCs,用不同浓度的西格列汀处理后检测细胞活力,以确定后续西格列汀实验浓度。采用1μg/mL LPS刺激诱导24 h建立hPDLSCs炎症模型并分为空白组、对照组、西格列汀低浓度组(0.5μmol/L)、西格列汀中浓度组(1μmol/L)、西格列汀高浓度组(2μmol/L)、西格列汀高浓度+基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)/CXC趋化因子受体4 (CXCR4)通路抑制剂(AMD3100)组(2μmol/L+10μg/mL)。细胞计数试剂盒-8检测培养24、48、72 h后的hPDLSCs增殖活性;流式细胞术检测培养72 h后hPDLSCs凋亡情况;诱导成骨分化21 d后茜素红染色检测hPDLSCs成骨分化能力,试剂盒测定hPDLSCs中碱性磷酸酶(ALP)活性;酶联免疫吸附检测hPDLSCs培养上清液中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测hPDLSCs中成骨分化相关基因Runt相关转录因子2 (RUNX2)、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)及SDF-1和CXCR4 mRNA表达;Western blot检测hPDLSCs中SDF-1、CXCR4蛋白表达。结果 与空白组比较,对照组hPDLSCs增殖活性、矿化结节数量、染色强度、ALP活性和RUNX2、OCN、OPN mRNA及SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白表达水平显著降低,凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.05);与对照组比较,西格列汀低、中、高浓度组hPDLSCs增殖活性、矿化结节数量、染色强度、ALP活性和RUNX2、OCN、OPN mRNA及SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白表达水平依次升高,凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6水平依次降低(P<0.05);AMD3100可部分逆转高浓度西格列汀对LPS诱导的hPDLSCs的作用效果(P<0.05)。结论 西格列汀可能通过激活SDF-1/CXCR4信号通路促进LPS诱导的炎症微环境下hPDLSCs的增殖和成骨分化,抑制hPDLSCs凋亡和炎症反应。

高糖炎性环境下KLF4调控人牙周膜干细胞能量代谢的机制初探

目的:探究高糖炎性环境下Krüppel样因子4(KLF4)对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)线粒体能量代谢和成骨分化的影响。方法:利用免疫荧光和Western blot实验研究高糖炎性环境下KLF4在hPDLSCs的定位和表达情况。通过碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色等检测高糖炎性环境下hPDLSCs成骨能力。通过慢病毒敲低和过表达技术,结合实时荧光定量PCR与Western blot实验检测病毒感染后KLF4的表达,检测KLF4对hPDLSCs成骨分化的影响。采用核酸酶靶向切割和释放(CUT&RUN)技术,分析高糖炎性环境下hPDLSCs中KLF4结合的DNA及相关信号通路变化。使用Seahorse能量代谢仪探索KLF4对hPDLSCs氧化呼吸能力的影响。结果:高糖炎性环境下,hPDLSCs中KLF4表达下调、ALP活性降低、钙结节形成减少(均P<0.001),Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)表达降低(均P<0.001)。敲低KLF4,导致hPDLSCs的ALP活性降低(P<0.001),钙结节形成减少(P<0.001);过表达KLF4促进hPDLSCs的成骨分化。高糖炎性环境下,KLF4下游调控基因富集于能量代谢、成骨等相关通路。敲低KLF4导致hPDLSCs线粒体耗氧率(OCR)水平下调,而细胞外酸化率(ECAR)水平上调;过表达KLF4使OCR水平上调,而ECAR水平下调。结论:在高糖炎性环境下,hPDLSCs的成骨分化能力受损,KLF4可能通过上调线粒体氧化磷酸化能力来恢复hPDLSCs的成骨分化能力。

LncRNA在牙周膜干细胞成骨分化中的作用

来源于牙相关组织的干细胞是口腔范围内特有的干细胞,对牙槽骨丢失后的再生或修复及牙槽骨的改建等具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)被发现参与牙相关组织干细胞的成骨向分化。本文就lncRNA在牙相关组织来源干细胞成骨分化过程中发挥的作用、调控的靶点及具体机制的最新研究进展进行综述。

纳米氧化铈材料对人牙周膜细胞及人牙龈细胞的促成骨作用研究

研究纳米氧化铈颗粒(CNPs)对人牙周膜细胞及人牙龈细胞的成骨活性的影响,并探索这些颗粒在两种细胞中的不同效果。方法 本研究采用BSA孵育法合成CNPs,并通过CCK-8实验、碱性磷酸酶(ALP)活性测定、茜素红染色和实时定量PCR(RT-qPCR)评估了CNPs对于人牙周膜细胞和牙龈细胞增殖、分化以及成骨能力的影响。结果 CNPs具有良好的生物相容性,并能显著促进牙周膜细胞和牙龈细胞的成骨活性,相较牙周膜细胞而言,牙龈细胞表现出更高的耐受性。结论 纳米氧化铈颗粒在适宜浓度下可显著提升牙周相关细胞的成骨活性,为牙周炎的治疗开辟了新思路。未来研究需在动物模型中进一步验证CNPs的长期安全性和有效性,并深入探讨其临床应用前的相关问题。

表面纳米形貌对牙周膜干细胞衰老的作用研究

目的探讨二氧化钛纳米管形貌对衰老牙周膜干细胞分化能力的影响。方法利用阳极氧化法,分别于20、70 V电压下制备出2种具有二氧化钛纳米管形貌的钛片(20V-NT、70V-NT),观察其表面形貌特征。在成骨诱导条件下培养年轻牙周膜干细胞,挑选具有促进成骨分化作用的表面形貌。用RO3306和Nutlin-3a诱导年轻牙周膜干细胞衰老,获得衰老的牙周膜干细胞。诱导衰老牙周膜干细胞成骨分化,观察表面形貌对衰老牙周膜干细胞成骨分化的影响。结果阳极氧化法可在钛片表面形成纳米管形貌,且纳米管直径随电压的增大而增大;不同直径纳米管形貌对年轻牙周膜干细胞成骨分化的影响存在较大差异,20V-NT表面纳米形貌促成骨分化效果更明显。与光滑钛片相比,20V-NT表面纳米形貌提高了衰老牙周膜干细胞碱性磷酸酶阳性数量,促进了钙沉积以及成骨标志性基因Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙素的表达。结论特定的表面纳米形貌能增强衰老牙周膜干细胞的分化能力,为牙周再生和进一步提高种植体的性能提供了一种有效方法。