芒柄花素促进牙囊干细胞成骨向分化

目的:研究芒柄花素对牙囊干细胞(human dental follicle stem cells,hDFSCs)成骨分化的影响。方法:首先对hDFSCs进行分离、培养及鉴定,并使用含不同浓度芒柄花素(0、0.1、1、10μmol/L)培养基培养细胞。通过CCK-8实验、结晶紫染色和活/死细胞荧光染色评估细胞的活性状况;通过细胞骨架荧光染色观察细胞骨架状况;采用RT-qPCR检测细胞成骨相关基因的表达变化;利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性检测法评估细胞成骨分化过程中ALP活性的影响;通过茜素红染色法评估细胞成骨分化过程中钙化结节数量的影响。结果:hDFSCs具有干细胞特性;不同浓度的芒柄花素对hDFSCs活性无显著性影响;1μmol/L的芒柄花素可显著促进Runx2、OCN、Col-Iα1的mRNA表达;并能够提高的细胞内ALP活性和钙化结节的数量。结论:1μmol/L芒柄花素可促进hDFSCs的成骨分化。

大肠杆菌脂多糖对大鼠牙囊干细胞生物学行为的影响

目的:探究大肠杆菌脂多糖(E.coli LPS)对大鼠牙囊干细胞(rDFSCs)生物学行为的影响。方法:体外培养鉴定rDFSCs,使用不同浓度(0、1、10μg/mL)E.coli LPS处理细胞,通过qRT-PCR检测炎症因子的表达;CCK-8法检测细胞增殖情况;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移能力;碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色分别评估rDFSCs的矿化情况,并利用qRT-PCR检测其成骨相关基因表达水平。结果:相比于对照组,LPS组IL-6、IL-1β及TNF-α的mRNA表达水平升高(P<0.05);1μg/mL LPS促进rDFSCs增殖及迁移能力(P<0.05),而10μg/mL LPS对其增殖、迁移影响不明显;LPS处理后ALP染色降低、矿化结节数量减少,且成骨标志物RUNX2、COL1及OPN表达下降(P<0.05)。结论:E.coli LPS模拟的炎症微环境下,rDFSCs成骨分化能力受到明显抑制,低浓度(1μg/mL)LPS刺激可促进rDFSCs的增殖和迁移。

人牙囊细胞的分离培养和生物学特性

目的 :应用酶消化法体外培养人牙囊细胞并研究其生物学特性。方法 :分离合法引产人胚胎乳牙胚的牙囊组织 ,消化法获得人牙囊细胞 ,HE染色观察细胞形态、免疫组织化学染色技术检测波形丝蛋白、Ⅰ型胶原表达 ,RT -PCR检测细胞的骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶的表达。结果 :原代培养的人牙囊细胞呈成纤维细胞形态 ,有部分上皮成分混杂 ,经纯化后可排除 ;在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和波形丝蛋白的表达呈阳性 ,定位于细胞的胞质中 ;RT -PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。结论 :体外培养的人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性 ,具有合成Ⅰ型胶原的能力 ;不同程度表达Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶等矿化相关蛋白。

小鼠牙囊细胞的体外分离培养鉴定及异质性研究

目的:建立小鼠牙囊细胞体外分离培养的方法,并对其起源进行鉴定,同时检测其生物学特性。方法:用1%的胰蛋白酶消化分离7天龄Balb/c小乳鼠的下颌第一磨牙牙胚的牙囊组织进行体外培养,波形蛋白和角蛋白鉴定细胞起源,HE染色观察细胞的形态,Gomori改良钙钴法进行细胞的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALPase)染色,免疫组化法检测细胞Ⅰ型胶原和骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达。结果:分离培养的细胞具有多形性,现有3种基本的细胞类型:立方形或多角形;长梭形;非常细长的细胞形状,前2种细胞胞核内有2～4个清晰的核仁,胞质内有大量颗粒,且有大量的线状伪足。波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,ALPase染色显示72.7%的牙囊细胞内的AL鄄Pase呈强阳性;免疫组化染色显示48.8%的牙囊细胞Ⅰ型胶原及8.75%的牙囊细胞的OCN表达阳性。结论:所培养的牙囊细胞源自间充质,含有多种细胞表型,具有异质性。

聚乳酸根管桩浸提液对人牙囊细胞生物学性能的影响

目的:观察聚乳酸根管桩浸提液对人牙囊细胞生物学功能的影响。方法:取第4代人牙囊细胞,分别用50%、100%聚乳酸根管桩浸提液作用1、3、5、7d,观察其对细胞增殖和凋亡的影响。结果:两种浓度聚乳酸根管桩浸提液组在各时间点的A值与正常培养液组相比均无显著差异(P>0.05),细胞毒性等级均为1级。活细胞百分率空白对照组为94.2%;100%浸提液组为84.5%,两组差异不明显,无统计学意义(P>0.05)。结论:可吸收性聚乳酸根管桩无明显细胞毒性,不会引起细胞凋亡。

大鼠牙囊细胞体外培养技术的建立及其鉴定

目的 建立体外培养大鼠牙囊细胞的方法 ,观察牙囊细胞体外生长的生物学特性。方法 分离乳鼠下颌第一、第二磨牙牙胚的牙囊组织 ,应用组织培养的方法进行牙囊细胞原代和传代培养。显微镜观察培养细胞的形态 ,电镜观察体内牙囊组织和体外培养的牙囊细胞的超微结构。免疫组化法检测细胞波形蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结果 分离组织培养 2 4h后 ,梭形细胞和多角形细胞从组织块中游出 ,经消化排除法获得纯化的牙囊细胞。显微镜下牙囊细胞为成纤维细胞样 ,电镜下牙囊细胞无桥粒 ,胞浆中含有高密度电子颗粒和大量粗面内质网 (RER)。免疫组化染色显示牙囊细胞表达波形蛋白、Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白。结论 运用组织培养和细胞生物学技术可以成功获得原代和传代培养的大鼠牙囊细胞 。

差速传代纯化大鼠牙囊细胞

目的:建立一种简捷的分离培养和纯化大鼠牙囊细胞的方法。方法:分离出生后6dSD大鼠上下颌第一和第二磨牙完整牙胚,剥离牙囊和成釉器,剪碎后酶消化并混合培养,再利用多次差速传代纯化牙囊细胞。结果:原代细胞为牙囊细胞和成釉器细胞混合生长,差速传代培养到第4代可获得纯化的牙囊细胞。倒置显微镜下观察牙囊细胞呈长梭形或三角形,免疫组化染色抗波形丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性。结论:利用多次差速传代可从混合培养的原代细胞中获得纯化的牙囊细胞。

牙本质基质对牙囊细胞增殖分化影响的体外研究

目的：研究牙本质基质（DM）对人牙囊细胞（h PFCs）增殖、分化的影响。方法：酶消化组织块法分离培养hDFCs,经鉴定后取第4代细胞并将其随机分为2组,分别用DM浸提液（实验组）和α-DMEM培养液（对照组）进行培养。然后分别用CCK-8法检测各组细胞在培养后1~7 d各时间点的增殖情况;用Western-blot检测培养7 d后各组细胞中ALP、Runx2、OPN、CP-23各成骨/成牙骨质相关基因的蛋白表达水平。结果：DM浸提液对h DFCs的增殖无明显促进作用（P〉0.05）,但能明显上调其ALP、Runx2、OPN、CP-23蛋白表达水平（P〈0.05）。结论：牙本质基质浸提液可诱导hDFCs向成骨/成牙骨质向分化。

白细胞介素-10对体外培养人牙囊细胞集落刺激因子-1表达的影响

目的:研究白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)对体外培养人牙囊细胞集落刺激因子-1(colonystimulatingfactor-1,CSF-1)表达的影响。方法:体外培养人牙囊细胞,取第5代细胞加入25ng/mlIL-10作用0、1、3、6、9、12h,用RT-PCR法检测CSF-1mRNA表达的变化。然后取第5代细胞,加入25ng/mlIL-10作用0、2、4、6、8h,用ELISA法检测上清液中CSF-1蛋白的含量。结果:牙囊细胞经IL-10作用后,CSF-1mRNA表达在3～12h降低,蛋白分泌在6～8h减少。结论:IL-10通过降低CSF-1的表达,间接地对单核细胞进入牙囊并在其中聚集发挥抑制作用,从而抑制破骨细胞吸收牙槽骨和牙齿萌出通道的形成。

矿化液对体外培养的人牙囊细胞碱性磷酸酶活性的影响

目的:探讨矿化液对体外培养的人牙囊细胞中碱性磷酸酶表达的影响。方法:取12～13岁患者因正畸原因拔除的下颌第三磨牙牙囊,原代培养人牙囊细胞,将第5代细胞加入矿化液培养,应用碱性磷酸酶组织化学方法染色、碱性磷酸酶试剂盒检测人牙囊细胞中碱性磷酸酶的活性。结果:培养的牙囊细胞呈长梭形、不规则多角形。免疫细胞化学染色显示抗波形丝蛋白染色阳性。矿化液诱导7d,碱性磷酸酶染色呈阳性,碱性磷酸酶活性检测第3、5、7d明显升高,与对照组均有显著性差异。结论:矿化液能增强体外培养的人牙囊细胞中碱性磷酸酶的表达。

大鼠牙囊细胞培养方法的探讨

【目的】探讨大鼠牙囊细胞体外培养的方法。【方法】分离出大鼠牙囊组织,分别采用组织块培养法、细胞消化分散法、及改良组织块法进行牙囊细胞原代及传代培养,倒置相差显微镜下进行细胞形态学观察,透射电镜观察细胞超微结构。【结果】培养至第3天,倒置相差显微镜观察发现,采用组织块培养法,见少数细胞从组织块爬出;而细胞消化分散法则可获得数量多的牙囊细胞,但与杂质细胞混杂生长;改良组织块法见量多、相对纯的牙囊细胞。电镜下牙囊细胞无桥粒,胞浆中含有高密度电子颗粒和大量粗面内质网。组织块法、细胞消化分散法和改良组织块法牙囊细胞培养成功率分别为80%、60%和100%;分别于10 d、7 d和6 d左右进行第一次传代。【结论】改良组织块法是一种良好的大鼠牙囊细胞培养方法。

大鼠牙囊细胞多向分化潜能的体外研究

目的:体外研究用差速贴壁法和有限稀释法纯化的大鼠牙囊细胞(Dental foilicle cells,DF-Cs)的多向分化潜能,为用于口腔组织工程的种子细胞奠定基础。方法:体式显微镜下准确分离7 d龄SD大鼠第一磨牙牙囊组织,使用酶消化法、有限稀释法、差速贴壁法进行培养和纯化细胞,取第3代细胞分别进行以下检测:①流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记;②骨向诱导、成脂诱导、成神经诱导和相关检测。结果:①差速贴壁法和有限稀释法纯化培养的大鼠牙囊细胞大多呈长梭形,部分细胞呈三角形,细胞形态呈现异质性;②流式细胞仪检测结果显示所获得的牙囊干细胞表面标记CD29、CD90阳性率分别为95.6%、98.6%,而CD45的阳性率仅为4.2%;③成骨诱导后,茜素红染色呈阳性,ALP染色显示ALP表达增强明显;成脂诱导后细胞胞浆内可见明显脂滴,油红O染色呈阳性;神经细胞诱导后细胞形态发生明显改变,神经微管蛋白染色呈阳性。结论:体外培养的大鼠牙囊细胞具有较强的多向分化能力,可作为口腔组织工程理想的种子细胞。

人牙囊细胞的培养及其特性

目的 :体外培养人牙囊细胞并研究其特性。方法 :取年龄为 12岁人埋藏阻生第三磨牙的牙囊 ,组织块法进行人牙囊细胞的培养 ,HE染色、扫描电镜观察人牙囊细胞的形态 ,免疫组织化学染色技术观察Ⅰ型胶原及波形蛋白在牙囊细胞中的表达及定位。结果 :培养的人牙囊细胞呈梭形、卵圆形及多角形 ,形似成纤维细胞 ;扫描电镜可见细胞多呈梭形 ,也可见多角形 ,所有细胞表面均有颗粒状物质 ,有的细胞表面多且密 ,有的细胞表面较少 ,折光性较强 ,细胞核周围分布较多 ;在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和波形蛋白的表达呈阳性 ,定位于细胞的胞质中 ,围绕细胞核周围染色较强 ,细胞核内染色阴性。结论 :体外可以培养人牙囊细胞 ,人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性 。

体外共培养人牙髓干细胞对人牙囊干细胞增殖、成骨分化的作用

目的通过体外建立人牙囊干细胞(human dental follicle stem cells,HDFSCs)和人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)共培养体系,研究HDPSCs对HDFSCs增殖、成骨分化的作用。方法 1利用改良的组织块-消化联合法、免疫组化方法、流式细胞术以及多向诱导方法对HDFSCs和HDPSCs进行分离、培养、鉴定;2采用0.4μm孔径的Transwell小室构建HDFSCs和HDPSCs体外共培养体系;3CCK-8测定HDFSCs增殖活性的变化;4与HDPSCs体外共培养1周,qRTPCR检测HDFSCs几个标志性成骨基因:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、人类相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)以及Ⅰ型胶原(collagen type 1,Col-1)的表达情况。结果 1成功分离、培养、鉴定HDFSCs和HDPSCs;2从第4天开始,共培养组HDFSCs的增殖活力明显高于对照组(P<0.05);3与对照组相比,共培养组ALP、Runx2、OPN、BSP、Col-1的相对表达量均明显增高(P<0.05)。结论与HDPSCs共培养能增强HDFSCs增殖活力及成骨分化。

SV40Tag基因片段转染SD大鼠牙囊细胞后相关生物学特性初步研究

目的转染猿肾病毒SV40Tag基因片段至SD大鼠牙囊细胞,获取具有无限增殖能力和稳定生物学性状的牙囊细胞用于牙周组织工程的研究。方法利用293细胞包装病毒构建含SV40Tag的逆转录病毒载体,制备重组逆转录病毒并转染至SD大鼠牙囊细胞。以正常牙囊细胞为对照,倒置显微镜下观察细胞形态及活力,分析细胞端粒酶活性,并检测其成骨分化及增殖特性。结果转染SV40Tag基因后,SD大鼠牙囊细胞传代至60代,生长依然旺盛,存在较强活力;牙囊细胞端粒酶活性显著增强,与对照组有统计学差异(P=0.033);牙囊细胞成骨分化相关基因(碱性磷酸酶、骨钙素、骨形态发生蛋白、Runx2基因)、促有丝分裂相关基因(碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子)的电泳条带与对照组均无统计学差异(P>0.05)。结论 SV40Tag基因片段转染SD大鼠牙囊细胞后具有无限传代增殖和抗衰老的潜在能力,其细胞生物学特性相对稳定,可为牙周组织工程提供较理想的种子细胞来源。

大鼠牙囊细胞体外培养与表型鉴定

目的:体外培养大鼠牙囊细胞(RDFCs),鉴定其细胞来源及表型,为牙周组织再生的研究提供可靠的种子细胞来源。方法:选择出生后6-7d SD仔鼠,分离上、下颌第一、第二磨牙牙胚,取牙囊组织进行原代和传代培养。通过倒置显微镜观察细胞形态及生长情况;波形丝蛋白(Vimentin,VIM)和角蛋白(Cytokeratin,CK)鉴定其细胞来源;免疫组化染色技术检测细胞骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen,CoL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(typeⅢ collagen,CoL-Ⅲ)及纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的表达。结果:细胞形态呈多形性,有长梭形,纺锤形、不规则三角形等,波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。免疫组化染色显示OPN、BSP、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ、FN在胞浆中呈不同程度的阳性表达。结论:大鼠牙囊细胞来源于外胚间充质,具有成纤维细胞的形态特征及成骨/成牙骨质细胞表型特征,可将牙囊细胞作为种子细胞用于牙周组织工程的再生研究。

巨噬细胞集落刺激因子对体外培养人牙囊细胞破骨细胞分化因子表达的影响

目的：研究巨噬细胞集落刺激因子对体外培养的人牙囊细胞破骨细胞分化因子（RANKL）mRNA表达的影响。方法：原代培养人牙囊细胞，传至第3代，制备细胞爬片，进行RANKL免疫组化染色；选取生长状态良好的第3-6代人牙囊细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，培养基中分别加入25ng／mL的巨噬细胞集落刺激因子，共同孵育0．5、1、3、6、12h，提取总RNA进行RT-PCR，灰度值半定量分析RANKL mRNA的变化。结果：正常人牙囊细胞RANKL蛋白表达阳性；25ng／mL的巨噬细胞集落刺激因子可升高人牙囊细胞RANKL的表达；共同孵育3h，RANKL表达最高。结论：巨噬细胞集落刺激因子对体外培养的人牙囊细胞表达RANKL，具有正向调节作用。

ADAM28真核表达质粒的构建及转染人牙囊细胞后的表达分析

目的:构建金属蛋白酶解离素28(ADAM28)真核表达质粒,转染人牙囊细胞(HDFC)后检测ADAM28在HDFC中的表达分布。方法:采用基因重组技术构建ADAM28真核表达质粒,通过细胞培养、脂质体Lipofectamine2000介导转染HDFC后,应用免疫荧光、RT-PCR及Western印迹检测ADAM28在HDFC中的表达。结果:成功构建并鉴定ADAM28真核质粒,瞬时转染HDFC72h后,检测证实真核质粒转染组的HDFC表达ADAM28蛋白,而2个对照组均无表达。结论:ADAM28在HDFC内能被正确翻译和表达,为进一步探讨其在牙源性细胞中的生物学功能奠定了基础。

ADAM28反义核酸对人牙囊细胞增殖和碱性磷酸酶的影响

目的:研究ADAM28反义核酸(AS-ODN)对人牙囊细胞(HDFCs)增殖和碱性磷酸酶(AKPase)活性的影响。方法:采用细胞培养、基因转染、四唑盐(MTT)比色法和酶动力学方法,检测ADAM28反义核酸对牙囊细胞增殖、分化和影响碱性磷酸酶活性的可能机制。实验数据采用单因素方差分析的q检验(SNK)进行统计学分析。结果:ADAM28反义核酸成功转染人牙囊细胞,MTT和AKPase活性检测显示:ADAM28AS-ODN组细胞增殖和AKPase活性均显著低于S-ODN组和空白对照组,其中MTT检测的组间P值分别为0.0002、0.0001,P均<0.01;AKPase检测的组间P值分别为0.0007、0.0003,P均<0.01,即ADAM28反义核酸可显著抑制HDFCs的增殖和AKPase的活性。结论:ADAM28可能通过参与Notch信号途径来促进牙囊细胞的增殖和分化。

人牙囊细胞与胶原凝胶复合煅烧骨三维培养的实验研究

目的:建立人牙囊细胞(dentalfolliclecells,DFCs)的体外三维立体培养模型。方法:取第4代DFCs分别 接种于煅烧骨(sinteredbovinebone,SBB)(A组)、胶原凝胶(B组)、胶原复合煅烧骨三维支架上(C组),并以二维 培养的DFCs(D组)作对照,1周、2周取材,扫描电镜观察细胞形态以及与材料的贴附情况,细胞计数观察细胞在 材料上的增殖情况,组织化学方法检测DFCs的碱性磷酸酶(ALP)活性。结果:扫描电镜见A组、B组和C组细胞 均完全伸展,但C组细胞数量明显增多,细胞外基质分泌增加,优于A组、B组和对照组D组,而对照组细胞在二维 培养条件下复层生长呈膜状结构,膜表面部分细胞脱落死亡,细胞外基质分泌较实验组少。A组与C组的ALP活 性无差异(P>0.05),但显著高于对照组B组和对照组(P<0.05)。1周时3组细胞Ⅰ型胶原合成情况无明显差 异,但2周时C组细胞的Ⅰ型胶原平均灰度值明显高于其他2组(P<0.01)。结论:A、B、C组对DFCs的贴附、增 殖,分化均有影响,但C组作支架最优。胶原凝胶与煅烧骨的复合支架更有利于牙囊细胞的增殖贴附和分化。