低浓度氟化钠对人牙髓细胞的成骨/成牙本质分化的影响

目的探讨低浓度氟化钠对人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)成骨/成牙本质分化的影响。方法本研究已通过单位伦理委员会审查批准。原代培养hDPCs,采用MTT法检测不同浓度氟化钠对hDPCs增殖的影响;选取合适浓度的氟化钠加入成骨/成牙本质分化诱导培养液中,对hDPCs进行体外诱导,通过茜素红染色检测hDPCs成骨/成牙本质分化能力的变化,RT⁃qPCR检测分化相关基因的mRNA表达;同时通过RT⁃qPCR和Western blot检测hDPCs成骨/成牙本质分化过程中内质网应激相关基因的表达。结果低浓度氟化钠(0.1 mmol/L)在体外可刺激hDPCs增殖,高浓度氟化钠(5~10 mmol/L)可抑制hDPCs增殖(P<0.05)。选取0.1 mmol/L氟化钠体外混合成骨/成牙本质分化诱导培养后hDPCs的茜素红染色增加,成骨/成牙本质分化相关基因牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)mRNA表达水平升高(P<0.05)。同时在此过程中RT⁃qPCR检测出mRNA水平hDPCs内质网应激相关基因:剪切x盒结合蛋白1(splicing x⁃box binding protein⁃1,sXBP1)、葡萄糖调节蛋白78(glucose⁃regulated protein 78,GRP78)以及活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)表达升高(P<0.05);Western blot检测出氟化钠混合成骨/成牙本质分化培养后细胞磷酸化真核起始因子⁃2α(phosphorylated eukary⁃otic initiation factor⁃2α,p⁃eIF2α)、磷酸化蛋白激酶样内质网激酶(phosphorylated the RNA⁃activated protein kinase⁃like ER⁃resident kinase,p⁃PERK)和ATF4蛋白表达增加(P<0.05)。结论低剂量氟化钠促进人牙髓细胞的成骨/成牙本质分化并伴有内质网应激水平的升高。

Chir99021调控Wnt/β-catenin信号通路抑制大鼠牙髓干细胞成骨诱导分化的机制

目的探讨Chir99021对大鼠牙髓干细胞(DPSCs)成骨诱导分化的影响及机制。方法原代分离大鼠DPSCs,利用荧光免疫法进行验证。设置不同浓度的Chir99021,通过CCK-8检测细胞增殖情况挑选最适浓度。利用茜素红染色验证细胞成骨诱导分化。最后通过Real-time PCR、Western blotting检测成骨诱导分化相关基因与蛋白无翅型MMTV整合位点家族成员1(Wnt1)、无翅型MMTV整合位点家族成员3A(Wnt3a)、β-连环蛋白(β-catenin)、轴抑制蛋白2抗体(Axin2)、骨钙素(OCN)、牙本质基质蛋白1(DMP1)的mRNA和蛋白表达情况。结果牙本质涎磷蛋白(DSPP)和干细胞标记物波形蛋白(vimentin)阳性表达,说明大鼠DPSCs分离成功。大鼠DPSCs成骨诱导后钙沉积物显著上升,加入糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的小分子抑制剂Chir99021后钙沉积物明显减少。大鼠DPSCs成骨诱导分化后Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN和DMP1表达明显上升,而加入Chir99021后Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN和DMP1蛋白表达均显著下降。结论Chir99021对诱导7 d后的大鼠DPSCs成骨诱导分化有一定的抑制作用。

circRNA SIPA1L1修饰牙髓干细胞来源外泌体促血管生成能力的机制

目的 探究环状RNA(circRNA)信号诱导增殖相关蛋白1样蛋白1(SIPA1L1)修饰的人牙髓干细胞(hDPSC)来源外泌体(Exo)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成能力的影响及机制。方法 从牙髓组织分离培养hDPSC,将circSIPA1L1过表达质粒载体转染至hDPSC后,分离Exo并进行鉴定。将HUVEC分为对照组、hDPSC Exo组、circSIPA1L1-hDPSC Exo组,培养48 h后,Matrigel基质胶血管形成实验检测血管形成能力,qRT-PCR和Western blot测定血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)、胎盘生长因子(PGF)的表达水平。结果 从未转染的hDPSC与转染circSIPA1L1的hDPSC中成功分离出Exo,且相较于h DPSC来源的Exo,转染circSIPA1L1的hDPSC来源的Exo中circSIPA1L1相对表达量显著上调(P <0.05)。与hDPSC Exo组比较,circSIPA1L1-hDPSC Exo组HUVEC的管样结构形成数目显著增加(P <0.05),VEGF、VEGFR2、PGF mRNA与蛋白相对表达量也显著上调(P<0.05)。结论 circRNA SIPA1L1修饰hDPSC来源的Exo能够促进血管生成,其机制可能与上调VEGF、VEGFR2、PGF的表达水平有关。

依普黄酮促进人牙髓干细胞增殖和成骨分化

目的:初步检测依普黄酮(IP)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)的增殖和成骨向分化的影响。方法:在体外对hDPSCs进行培养鉴定,用含IP(10^(-9)~10^(-5) mol/L)的完全培养液培养hDPSCs,CCK-8法检测不同时间点(1、2、3 d)的细胞活性;用含IP(10-8~10^(-5) mol/L)的矿化诱导液诱导hDPSCs 7 d,通过碱性磷酸酶活性测定、ALP染色、茜素红染色及RT-qPCR检测IP对hDPSCs成骨分化的影响。结果:CCK-8检测结果表明10^(-9)~10^(-5) mol/L IP均可促进hDPSCs增殖,其中10^(-6) mol/L IP组促进增殖效果最佳(P<0.05);10^(-6) mol/L IP组ALP染色加深,ALP活性增高(P<0.05),矿化结节增多(P<0.05);RT-qPCR检测结果显示10^(-6) mol/L IP组能够提高成骨分化相关基因骨钙素(osteocalcin,OCN)、碱性磷酸酶和矮小相关转录基因2的表达水平(P<0.05)。结论:10^(-6) mol/L IP能提高hDPSCs增殖和成骨向分化的能力。

牙髓干细胞治疗糖尿病的研究进展

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病,由胰岛素抵抗或胰岛素分泌异常引起,因胰岛β细胞的破坏导致患者持续高血糖,可诱导多发性神经病变等并发症,患病率与死亡率均较高。牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)获取容易,具有自我更新、多向分化及高度增殖的能力,可被诱导分化为胰岛β细胞参与胰岛素分泌和免疫调节,在慢性疾病的治疗中取得了一定成果。此外,DPSCs还可通过抑制自身免疫、调节炎症及抗氧化应激等途径改善1型糖尿病患者症状。本文综述了DPSCs的生物学特性并探究其通过对DM及其并发症治疗不同机制,以期完善DM管理。

Milliplex方法在人炎症牙髓组织中多种细胞因子的检测应用

目的采用Milliplex多因子检测技术检测人恒牙炎症牙髓组织中多种炎性细胞因子的表达,探讨炎症因子变化能否作为辅助评估牙髓炎症程度的指标。方法选取2019年3月至2021年3月,128名就诊于首都医科大学附属北京口腔医院的患者,按临床牙髓炎症程度由轻到重分为四组:正常牙髓组(正常组,n=30)、轻度牙髓炎组(轻度组,n=32)、中度牙髓炎组(中度组,n=31)、重度牙髓炎组(重度组,n=35)。收集患牙穿髓孔处的牙髓组织渗出液,用Milliplex多因子检测技术检测样本中GM-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-17A、IL-1β、IL-6、IL 8以及TNF-α的浓度并进行统计分析。结果随着牙髓炎症程度的加重,牙髓组织渗出液中促炎因子IL-6、IL-8浓度各组间浓度差异明显,呈明显递增趋势,组间两两比较均有显著性差异;IL-1β浓度总体呈递增趋势,重度组明显增高,正常组、轻度组、中度组与重度组间、正常组与中度组间有统计学差异;TNF-α、IL-17A浓度在重度组有所增高,较正常组、轻度组和中度组有显著性差异,但各组间数值差异较小;IFN-γ、GM-CSF、IL-10各组间浓度变化不明显。结论随着牙髓炎症的进展,牙髓组织渗出液中IL-6、IL-8浓度呈明显递增趋势,有可能作为评估牙髓炎症状态的指标,IL-8灵敏度最高,可能成为关键指标。IL-1β浓度在重度牙髓炎中明显升高,可能与牙髓炎症的急性发展有关。

负载骨形态发生蛋白2水凝胶诱导牙髓干细胞的成骨分化

背景:前期研究证明,甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶支架可促进人牙髓干细胞的增殖及分化。水凝胶负载骨形态发生蛋白2被认为是骨修复中有前景的材料。目的:观察负载不同质量浓度骨形态发生蛋白2的甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶对人牙髓干细胞成骨向分化的诱导作用。方法:制备含0,50,100,200μg/mL骨形态发生蛋白2的甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶,分别记为GelMA/TDM、BMP-2(50 ng/mL)GelMA/TDM、BMP-2(100 ng/mL)GelMA/TDM、BMP-2(200 ng/mL)GelMA/TDM,检测复合水凝胶对骨形态发生蛋白2的体外缓释性能。采用改良组织块酶消化法提取人牙髓干细胞,分别接种于4种水凝胶表面,采用CCK-8法检测细胞增殖,DAPI染色检测细胞黏附;对各组水凝胶表面的人牙髓干细胞进行成骨诱导,进行碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测与茜素红染色,采用RT-PCR法检测相关成骨基因(Runx2、骨形态发生蛋白2、骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原)表达。结果与结论:①甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质复合水凝胶可持续释放骨形态发生蛋白2长达21 d,在第3-6天释放较快,第6天之后释放趋于平稳;②4种水凝胶均可促进人牙髓干细胞的增殖,其中以BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶的作用最明显;相较于GelMA/TDM复合水凝胶,BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶可促进人牙髓干细胞的黏附,其中以BMP-2(200 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶的作用最明显;③相较于GelMA/TDM复合水凝胶,BMP-2-GelMA/TDM复合水凝胶可提升碱性磷酸酶活性、钙结节含量与相关成骨基因表达,综合分析显示BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶的作用更明显;④结果表明,BMP-2(100 ng/mL)-GelMA/TDM复合水凝胶促进牙髓干细胞成骨向分化的能力更明显。

活化α7乙酰胆碱受体促进LPS刺激的人牙髓干细胞牙/骨向分化

目的:探讨活化α7乙酰胆碱受体(alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR)联合钙离子(calcium ion,Ca^(2+)对LPS刺激的人牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)牙/骨向分化的影响。方法:分离培养DPSC,流式细胞术对DPSC进行表面标志物表达鉴定。CCK-8检测α7-nAChR激动剂PNU-282987和Ca^(2+)对DPSC增殖的影响。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和染色筛选PNU-282987促进DPSC表达ALP活性的最佳浓度。用大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)模拟炎性微环境刺激DPSC。采用免疫印迹分析(Western blot,WB)、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)和茜素红染色等方法检测牙/骨向分化的相关蛋白:Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,COL-I)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialoprotein,DSPP)、骨钙素(osteopontin,OPN)、ALP、核心转录因子-2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX),相关基因(COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX)和矿化基质表达情况。Fura-2AM用于检测细胞内Ca^(2+)流动情况。结果:CCK-8实验显示,PNU-282987浓度低于10μmol/L时对细胞增殖无抑制作用,且此浓度处理LPS刺激的DPSC后ALP活性增加最明显;Ca^(2+)浓度低于2 mmol/L对细胞增殖无抑制作用;Western blot和RT-qPCR实验显示,PNU-282987及Ca^(2+)处理后的LPS刺激的DPSC牙/骨向分化相关蛋白(COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX)和相关基因(COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX)的表达及矿化基质形成均明显上调,二者联合后上调最显著(P <0.001)。Fura-2 AM钙离子探针结果显示DPSC细胞内Ca^(2+)浓度增加。结论:10μmol/L PNU-282987联合2 mmol/L Ca^(2+)可以促进LPS刺激的DPSC的牙/骨向分化能力。

PDGFD对人牙髓干细胞迁移及成牙本质向分化的作用

目的:探讨人重组血小板来源的生长因子D(platelet-derived growth factor D,PDGFD)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)迁移及成牙本质向分化的作用。方法:利用酶解法分离培养hDPSCs,流式细胞术鉴定所培养的间充质干细胞表面分子标志物的表达,诱导hDPSCs三系分化并使用相应染色鉴定,以表征其多向分化潜能。应用细胞划痕实验检测PDGFD对hDPSCs迁移能力的影响,利用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测PDGFD对hDPSCs成牙本质相关mRNA及蛋白表达的影响,利用碱性磷酸酶(alkaline phosphataseI,ALP)和茜素红(alizarin red staining,ARS)染色检测PDGFD对hDPSCs矿化的影响。采用SPSS 26.0软件包对数据进行统计学分析。结果:细胞形态学分析、流式细胞术鉴定和三系分化结果显示,所分离得到的细胞符合hDPSCs特征,并且具有多向分化潜能。细胞划痕实验结果表明,12 h时,仅50 ng/mL的PDGFD对hDPSCs的迁移能力有影响;24 h时,10和50 ng/mL的PDGFD对hDPSCs的迁移能力均有影响。PCR结果显示,10与50 ng/mL的PDGFD均对hDPSCs的成牙本质分化有促进作用,50 ng/mL的PDGFD对hDPSCs的成牙本质分化更为显著。蛋白免疫印迹实验、ALP及ARS染色所得结果和PCR结果相同。结论:成功分离并培养了具有典型间充质干细胞表型和多向分化潜能的hDPSCs。10和50 ng/mL浓度的PDGFD对hDPSCs的迁移和成牙本质向分化均有促进作用,其中50 ng/mL的PDGFD的促进作用更为显著。

光交联复合水凝胶支架中人牙髓干细胞的成骨/成牙分化能力

背景:甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin-methacryloyl,Gel-MA)与经处理牙本质基质(treated dentin matrix,TDM)在一定比例下经过紫外线交联后形成的复合水凝胶支架具有良好的孔隙率、机械性能、溶胀性能及生物降解率,这为临床上年轻恒牙的牙髓再生提供了新的思路和方法。目的:探究1∶2质量比Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架对人牙髓干细胞增殖能力及成骨/成牙本质分化能力的影响。方法:将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中,采用CCK-8实验检测人牙髓干细胞在复合水凝胶支架中的增殖能力。将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中并进行成骨诱导,采用碱性磷酸酶染色及茜素红染色观察矿化结节的形成情况,采用RT-PCR检测成牙相关因子(牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白)和成骨相关因子(骨钙素、Runt相关转录因子2)的基因表达。结果与结论:①CCK-8检测结果显示,前7 d的牙髓干细胞增殖能力明显升高,第10天时速度减缓;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节生成强于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05);③RT-PCR结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞中牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因表达量明显高于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05),且14 d基因表达量明显高于7 d(P<0.05)。结果表明,培养在1∶2 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架上的牙髓干细胞表现出较好的增殖能力,能够强化牙髓干细胞的成骨、成牙本质分化能力。

LncRNA HCG18/miR-125b/TP53调控牙髓干细胞向神经元细胞分化的研究

目的旨在探讨LncRNA HCG18通过负调控miR-125b上调TP53对人牙髓干细胞(DPSCs)向神经元样细胞分化的影响。方法从正畸牙拔除术中获取的前磨牙中分离人DPSCs,将DPSCs诱导分化为神经元样细胞。qRT-PCR检测分化过程不同阶段HCG18、miR-125b的表达。在DPSCs细胞中转染oe-HCG18、pcTP53、miR-125b mimic及阴性对照,以qRT-PCR及WB方法检测各组Nestin、β-Ⅲtubulin、NSE的mRNA和蛋白,高尔基染色法评定各组树突棘密度以检测神经元发育情况。结果与未经诱导的DPSCs相比,DPSCs诱导分化组细胞的Nestin在分化期间先增高后降低,NSE、β-Ⅲtubulin及miR-125b表达水平逐渐升高,HCG18水平下调(P<0.05)。HCG18能抑制DPSCs向神经元样细胞分化,而miR-125b mimic能部分逆转HCG18对DPSCs神经分化的抑制,TP53能部分逆转miR-125b mimic对DPSCs神经分化的影响。结论HCG18能够通过负调控miR-125b激活TP53,抑制人DPSCs向神经元样细胞分化。

DSPP与BMP-2在牙髓干细胞修复再生牙髓牙本质复合体中的表达及意义

目的 探讨牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)与骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)在第三代同质异体牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSCs)再生修复牙髓牙本质复合体后的表达和意义,为年轻恒牙牙髓根尖周疾病提供新的诊疗思路。方法 18只SD大鼠随机分为实验组和对照组,两组均在全麻下摘除大鼠上颌双侧第一磨牙冠髓,实验组同期髓腔定植体外培养的同质异体大鼠牙髓干细胞,对照组冠髓摘除后不进行任何处理,术后均使用玻璃离子充填封闭髓腔。两组动物均于术后2、4、6周处死,取其上颌骨进行免疫组织化学方法检测DSPP和BMP-2的表达。结果 术后2、4、6周时,实验组牙髓牙本质复合体处的DSPP、BMP-2的表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 同质异体牙髓干细胞再植后会增加牙髓牙本质复合体处的DSPP和BMP-2的表达,有助于修复再生牙髓牙本质复合体。

miR-26b对人脱落乳牙牙髓干细胞及人脐带间充质干细胞增殖、迁移和成骨分化的影响

背景:microRNA-26b(miR-26b)对干细胞的多种功能具有重要的调节作用,但其对人脱落乳牙牙髓干细胞和人脐带间充质干细胞生物学特性的影响尚不清楚。目的:探讨miR-26b对人脱落乳牙牙髓干细胞和人脐带间充质干细胞增殖、迁移和成骨分化的影响。方法:培养及鉴定人脱落乳牙牙髓干细胞和人脐带间充质干细胞;用miR-26 mimics(实验组)和miRNAs mimics对照(对照组)转染2种细胞,构建过表达模型用于后续实验。CCK-8法检测过表达miR-26b细胞的增殖能力;Transwell和划痕实验分析过表达miR-26b细胞的迁移能力;RT-qPCR法检测过表达miR-26b细胞成骨诱导后成骨标志物的表达。结果与结论:①转染miR-26b模拟物可提高2种细胞中miR-26b表达量,促进人脱落乳牙牙髓干细胞增殖,对人脐带间充质干细胞的扩增无明显影响;②相较于对照组,2种细胞过表达miR-26b后迁移能力增强;③miR-26b在2种细胞成骨分化过程中表达水平降低;④相较于对照组,2种细胞过表达miR-26b后,成骨相关基因骨钙素、骨桥素、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白mRNA水平均下调。结果表明,过表达miR-26b能促进人脱落乳牙牙髓干细胞增殖、迁移,抑制其成骨分化;也促进人脐带间充质干细胞迁移,抑制其成骨分化,但对其增殖无明显影响。

牙源性间充质干细胞外泌体在牙髓再生中的作用机制

牙髓再生是一种基于组织工程治疗牙髓坏死的新策略,应用种子细胞结合支架和生长因子,实现牙本质、血管和神经的新生。外泌体是一类直径约为30~150 nm的细胞外囊泡,在调控细胞间信息和物质传递中发挥重要作用。2016年以来,牙源性间充质干细胞分泌的外泌体因其在牙髓组织再生领域展现出的巨大潜力而备受瞩目。本文介绍了牙源性间充质干细胞来源外泌体的种类和培养环境,并对牙源性间充质干细胞外泌体调控细胞成牙本质向分化、血管生成、神经再生和成骨向分化的作用和机制作一综述。

牙髓干细胞来源的凋亡囊泡对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响

背景间充质干细胞来源的凋亡囊泡具有促进骨组织再生的作用,目前关于人牙髓干细胞凋亡囊泡(apoptotic vesicles derived from human dental pulp stem cells,hDPSC-apovs)用于骨组织再生的研究尚未见报道。目的探讨hDPSC-apovs对小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells,mBMSC)增殖和成骨分化能力的影响。方法原代培养、分离和鉴定hDPSC,采用星孢素(staurosporine,STS)诱导细胞凋亡,高速离心法分离hDPSC-apovs并鉴定。将mBMSC与不同浓度的hDPSC-apovs(0μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL)进行共培养,CCK-8法检测不同浓度hDPSCapovs对mBMSC增殖能力的影响。mBMSC与不同浓度的hDPSC-apovs在成骨诱导培养基中共培养7 d后,茜素红染色分析钙结节形成,qPCR检测各组mBMSC的成骨分化相关基因Alp、Runx2、Spp1、Bglap的表达。结果与不含hDPSCapovs的对照组相比,0.2μg/mL、lμg/mL浓度hDPSC-apovs均能够促进mBMSC的增殖(P<0.05),而5μg/mL、25μg/mL浓度hDPSC-apovs则抑制mBMSC的增殖(P<0.05)。各浓度hDPSC-apovs处理组的钙结节形成量均高于对照组(P<0.05);qPCR结果显示,5μg/mL、25μg/mL组Alp、Runx2、Spp1、Bglap表达均上调(P<0.05),1μg/mL组只有Alp和Runx2表达上调,0.2μg/mL组仅有Alp表达水平上调(P<0.05)。结论在本研究浓度范围内,低浓度的hDPSC-apovs对mBMSC增殖具有促进作用,高浓度则表现为抑制作用;hDPSC-apovs对于mBMSC的成骨分化有一定促进作用,且不同浓度hDPSCapovs对成骨相关基因表达的影响不同。

炎症微环境中TOM40对牙髓成纤维细胞线粒体呼吸功能的影响

目的:探究炎症微环境中线粒体外膜转位酶(TOM)复合体亚基TOM40对牙髓成纤维细胞线粒体呼吸功能的影响。方法:开髓暴露法构建大鼠磨牙牙髓炎模型,苏木精-伊红染色观察牙髓坏死面积;免疫组化染色观察牙髓组织促炎因子白介素(IL)-1β、抗肿瘤坏死因子(TNF)-α及DNA氧化损伤标志物8-OHDG的表达情况;TUNEL法检测牙髓组织细胞凋亡情况。体外培养人牙髓成纤维细胞(hDPFs),分别以1、5、10μg/mL脂多糖(LPS)炎性刺激,实时荧光定量PCR及Western blot检测细胞促炎因子IL-1β、TNF-α及促凋亡因子Bax、Bak的表达情况;通过TMRE、DCFH-DA探针及腺苷三磷酸(ATP)含量检测试剂盒检测hDPFs线粒体呼吸功能变化;实时荧光定量PCR筛选TOM复合体中表达下调亚基,并通过免疫荧光染色加以验证;基于筛选结果构建TOM40过表达hDPFs细胞株,并加入LPS刺激,检测线粒体呼吸功能变化。结果:大鼠磨牙牙髓炎模型中,随着暴露时间延长,牙髓坏死面积增大,IL-1β、TNF-α及8-OHDG表达升高,细胞凋亡增多(P<0.05)。炎症hDPFs模型中,LPS浓度增加,IL-1β、TNF-α、Bax及Bak蛋白和基因表达升高,线粒体呼吸功能受损,TOM40表达特异性下调(P<0.05);而过表达TOM40可有效改善LPS刺激导致的hDPFs线粒体膜电位下降、活性氧积累与ATP含量下降(P<0.05)。结论:牙髓炎的发展过程伴随牙髓组织氧化应激与hDPFs线粒体呼吸功能障碍,过表达TOM40可挽救hDPFs受损的线粒体呼吸功能。

基于核壳结构微囊构建三维牙髓细胞球及初步体外研究

目的:利用同轴静电液滴技术设计并制备一种用于牙髓干细胞(DPSCs)三维细胞球体构建、培养的核壳微囊。方法:获取临床收集DPSCs并通过流式细胞仪进行细胞鉴定;构建核壳微囊,调节内外相溶液浓度、流速和细胞密度等参数,对比微囊形貌及尺寸筛选最佳制备条件;活/死染色和CCK-8实验检测微囊内的细胞球的细胞活性,免疫荧光染色观察细胞骨架。结果:成功分离培养DPSCs,构建以海藻酸钠(Alg)为壳层和羧甲基纤维素(CMC)为核层的载细胞微囊。当细胞密度为1×108个/mL时,微囊内的DPSCs在24 h内能自发形成直径为(101.93±10.11)μm的单一球体。活/死染色显示培养7 d内细胞存活率未明显降低(P>0.05),CCK-8显示培养4 d时细胞增殖率增加至(114.91±7.70)%(P<0.05),7 d时增长至(169.05±5.29)%(P<0.001)。细胞在微囊内形成致密结构。结论:该方法制备的核壳微囊可以促进DPSCs形成三维细胞球并长期存活。

高糖对乳牙牙髓干细胞生长及成骨分化能力的影响

目的探讨高糖对乳牙牙髓干细胞(SHED)生长及成骨分化能力的影响。方法从河南大学赛思口腔医院口腔颌面外科收集拔除的6~8岁无牙体牙髓牙周疾病的健康儿童的滞留乳牙,体外培养获得SHED,实验分为5.5 mmol·L^(-1)低糖组及25 mmol·L^(-1)高糖组。用细胞计数CCK-8试剂盒(CCK-8)检测两组细胞的增殖速度。分别用含两种不同糖浓度的成骨矿化液诱导21 d后,行茜素红染色实验,实时荧光定量PCR(QPCR)技术检测骨向分化相关基因碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)表达的差异。结果CCK-8检测结果显示,培养2~6 d时高糖组的OD值小于低糖组(P<0.05);成骨诱导后,高糖组的钙化结节数量少于低糖组,且高糖组的RUNX-2、ALP、OCN和OPN的相对表达量低于低糖组(P<0.05)。结论高糖抑制SHED的生长及成骨分化能力。

METTL7A通过m6A甲基化调控牙髓干细胞的衰老和成骨/成牙分化

目的:探索甲基转移酶样7A(METTL7A)通过N6-甲基腺苷(m6A)甲基化对牙髓干细胞(DPSCs)衰老和成骨/成牙分化的影响。方法:利用慢病毒转染DPSCs获得METTL7A稳定敲低的DPSCs,利用逆转录病毒转染DPSCs获得METTL7A稳定过表达的DPSCs,实时荧光定量PCR和Western blot实验检测敲低及过表达效率。在此基础上,利用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色及定量检测METTL7A是否调控DPSCs的衰老,斑点杂交实验检测METTL7A是否调控DPSCs的m6A甲基化水平。METTL7A过表达组加入m6A甲基化抑制剂环亮氨酸(Cyc)后,利用SA-β-gal染色及定量检测和碱性磷酸酶(ALP)活性实验检测METTL7A通过m6A甲基化调控DPSCs的衰老和成骨/成牙分化。结果:利用慢病毒转染DPSCs,与对照组(Consh)相比,METTL7A基因和蛋白在METTL7A敲低组(METTL7Ash)的表达显著降低(P<0.01),METTL7Ash组的SA-β-gal染色及定量检测发现阳性细胞数量增加(P<0.05);利用逆转录病毒转染DPSCs,与对照组(Vector)相比,METTL7A在METTL7A过表达(HA-METTL7A)组的表达显著增加(P<0.01),HA-METTL7A组的SA-β-gal染色及定量检测显示阳性细胞数量减少(P<0.01)。此外,相比于Consh组,METTL7Ash组DPSCs的m6A甲基化修饰水平显著降低,而过表达METTL7A组DPSCs的m6A甲基化修饰水平明显升高。在此基础上,在METTL7A过表达组加入Cyc,SA-β-gal染色及其定量检测显著增加因METTL7A过表达而减少的阳性细胞数量(P<0.01),同时也显著抑制因METTL7A过表达促进的ALP活性(P<0.05)。结论:METTL7A可能通过调控m6A甲基化水平抑制DPSCs的衰老并促进其成骨/成牙分化。

促红细胞生成素干预牙髓损伤后修复性牙本质形成及骨形态发生蛋白2的表达

背景:促红细胞生成素具有抗炎、抗凋亡、促进骨缺损修复等作用,目前关于促红细胞生成素对牙髓损伤后修复性牙本质形成及其相关分子机制的研究较少。目的:探究促红细胞生成素对牙髓损伤后修复性牙本质形成的影响。方法:(1)动物实验:采用随机数字表法将32只大鼠随机分为对照组(n=16)与实验组(n=16),实验组牙髓损伤处使用含促红细胞生成素的胶原蛋白海绵直接盖髓,对照组露牙髓损伤处使用含PBS的胶原蛋白海绵直接盖髓,用玻璃离子粘固剂封闭窝洞;治疗2,4周后取上颌骨,采用免疫组化染色检测巢蛋白在牙本质中的表达,苏木精-伊红染色观察修复性牙本质生成。取4只SD大鼠上颌骨,免疫组化染色检测磨牙与切牙中促红细胞生成素表达。(2)细胞实验:从人牙髓组织、牙周韧带组织及牙龈组织中分别分离获取人牙髓细胞、人牙周韧带细胞和人牙龈成纤维细胞,采用RT-PCR检测促红细胞生成素mRNA表达。在成牙本质细胞诱导或未诱导分化条件下,采用RT-PCR检测人牙髓细胞中促红细胞生成素、牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、巢蛋白m RNA表达。在成牙本质细胞诱导或未诱导分化条件下,下调促红细胞生成素表达或外源性给予促红细胞生成素干预后,采用RT-PCR检测人牙髓细胞牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1 mRNA相对表达,茜素红S染色检测矿化结节形成,RT-PCR与Western blotting检测骨形态发生蛋白2 mRNA与蛋白表达。结果与结论:(1)动物实验:与对照组相比,实验组治疗2,4周后的修复性牙本质生成量更大,牙本质中巢蛋白表达更高。促红细胞生成素在大鼠上颌第一磨牙牙髓、成牙本质细胞层和牙周膜中呈弱阳性表达,在成牙本质细胞中呈强阳性表达。(2)细胞实验:与其他两种细胞相比,人牙髓细胞中的促红细胞生成素m RNA表达更高。与未诱导分化相比,成牙本质细胞诱导分化下人牙髓细胞中牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、巢蛋白、促红细胞生成素与骨形态发生蛋白2 mRNA表达升高,矿化结节生成增加。在成牙本质细胞诱导分化下,下调促红细胞生成素表达后人牙髓细胞中牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、巢蛋白、骨形态发生蛋白2 mRNA表达与矿化结节生成均降低,骨形态发生蛋白2蛋白表达降低;外源性给予促红细胞生成素干预后,人牙髓细胞中上述指标表达均升高。(3)结果表明:促红细胞生成素对牙本质形成具有一定的促进作用。