MiR-31促进人牙髓间充质干细胞增殖和迁移

牙髓炎和根尖周炎是口腔科目前较为常见的2种疾病,现有的治疗方案主要包括根管治疗和牙髓血运重建,能有效控制住炎症进而保存患牙,然而同时也会导致牙髓组织的永久失活,发生结构故障和继发感染。近年来,结合干细胞和生物材料等的组织工程技术使牙髓再生的研究逐渐进入人们的视野,其中从恒牙或乳牙中分离的牙髓间充质干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs),因其多向分化和高增殖等特性已成为牙本质或者髓样组织再生的重要的干细胞来源。但是由于干细胞不能高效募集到损伤区域,影响受损区的活细胞数量和存活时间,显著降低了其应用疗效,因此,需要提高牙髓干细胞的迁移和增殖能力,本研究旨在探讨微核糖核酸31(microRNA-31,miR-31)能否有效提高DPSCs的增殖迁移能力。通过组织块酶消化法从牙髓组织中成功分离培养了DPSCs,比较了分别取自健康牙与炎症牙的牙髓组织和DPSCs中miR-31水平的差异,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测的结果显示,与健康牙比较,炎症牙来源的牙髓组织和DPSCs中miR-31表达水平明显降低(P<0.05)。干扰和过表达DPSCs中的miR-31表达,具体分为NC组、miR-31 agomir(过表达)组和miR-31 antagomir(抑制剂)3个组,RTq-PCR结果显示,其转染成功(P<0.001)。CCK-8、细胞划痕以及Transwell迁移结果表明,与对照组相比,过表达miR-31成功提高了牙髓干细胞的增殖和迁移能力(P<0.05),且进一步通过Western印迹结果发现,过表达miR-31后增殖关键蛋白质增殖抗原(Ki67)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)以及迁移关键蛋白质CXC趋化因子受体4型(CXC chemokine receptor type 4,CXCR4)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2,MMP2)的蛋白质水平均显著升高(P<0.05)。本研究表明,miR-31能有效提高DPSCs的增殖迁移能力,以期为DPSCs更好应用于再生医学提供了有力的理论支持。

阿司匹林影响人牙髓间充质干细胞成骨分化的新型药理研究

目的通过体外成骨分化诱导实验探究阿司匹林对牙髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制,以此作为突破口,为牙质再生提供新思路。方法体外成功分离并培养人牙髓间充质干细胞,采用含转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的成骨诱导分化培养基,诱导分化20天后,采用碱性磷酸酶染色,观察不同浓度阿司匹林对牙髓间充质干细胞成骨分化的影响,并采用实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测与成骨相关转录因子(Runx2、Osterox、ALP)和细胞增殖相关干性基因(Sox2、Nanog、Oct4)的表达。结果成功体外分离并培养人牙髓间充质干细胞,成骨诱导20天后,结果显示,阿司匹林可明显促进人牙髓间充质干细胞成骨分化。随着阿司匹林浓度逐渐增加,碱性磷酸酶染色的染色率明显上调;细胞克隆数显著降低;实时定量PCR检测显示,与成骨相关转录因子(Runx2、Osterox、ALP)的表达均显著上调,但与细胞增殖相关干性基因(Sox2、Nanog、Oct4)的表达均显著下调。结论阿司匹林可影响人牙髓间充质干细胞成骨分化,可显著提高碱性磷酸酶的染色率,并上调与成骨相关转录因子的表达。以促进人牙髓间充质干细胞成骨分化为突破口,可为牙质再生提供新思路。

人牙髓间充质干细胞致瘤性试验

目的观察人牙髓间充质干细胞(HDP-MSCs)对免疫缺陷小鼠的致瘤性作用。方法雌性NOG小鼠随机分为4组:对照组和HDP-MSCs低、中、高剂量(2×10^(6)、5×10^(6)和2×10^(7)cells/kg)组,每组20只;双后肢交替im给药,每周给药1次,共给药6个月(27次);试验期间进行大体观察、体质量检查和肿瘤触诊,给药结束进行解剖检查、脏器检查和组织病理学检查。结果对照组死亡2只动物,其中1只动物颈部出现肿块;HDP-MSCs低剂量死亡1只动物,另有1只动物出现弓背;中剂量组1只动物濒死;高剂量动物未见明显异常;低、中、高剂量组触诊未发现肿瘤。小鼠体质量无异常。解剖后对照组和HDP-MSCs低、中剂量个别动物发现有肿块。各剂量组脏器质量及系数无异常、组织病理学检查无药物相关性病变。结论HDP-MSCs在本试验剂量下连续im给药6个月,致瘤试验结果为阴性。

佛手柑内酯对人牙髓干细胞成骨分化的影响

目的:探究佛手柑内酯(bergapten,BP)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cell,hDPSC)成骨分化的影响。方法:流式鉴定hDPSC的表面特异性抗原;使用CCK-8法检测BP的生物毒性与生物安全性;将hDPSC随机分为对照组与BP组,BP组分别加入含7.5、15.0、30.0μmol/L BP的完全培养基,对照组加入含等体积二甲基亚砜溶液(dimethyl sulfoxide,DMSO)的完全培养基,采用荧光显微镜观察各组细胞形态。使用BCIP/NBT碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)显色及ALP定量检测法检测BP对hDPSC早期成骨分化的影响;使用茜素红(alizarin red S,ARS)染色法及半定量分析法评估成骨分化晚期细胞外基质矿化程度;利用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测BP对于Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、ALP等成骨标志基因表达水平的影响;使用免疫印迹分析检测成骨分化蛋白指标的变化。结果:CCK-8实验结果表明7.5、15.0、30.0μmol/L BP生物安全性较好(P<0.01);与对照组相比,BP组细胞ALP染色更明显,15.0μmol/L组ALP活性水平更高(P<0.01);与对照组相比,BP组细胞外基质矿化水平更高,15.0μmol/L BP处理后结节最多最深;与对照组相比,BP组成骨相关基因和蛋白的表达均明显增多且15.0μmol/L处理略优(P<0.01)。结论:一定浓度的BP具有良好的生物安全性,且能对hDPSC的成骨分化产生促进作用,15.0μmol/L成骨诱导效果较优。

机械敏感离子通道Trpm7在LIPUS促进牙髓间充质干细胞成骨分化中的作用机制的研究

该文主要研究低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)促进牙髓间充质干细胞(dental pulp mesenchymal stem cells,DPSCs)成骨分化,以及瞬时受体电位M7(transient receptor potential melastatin 7,Trpm7)在其中发挥的作用。培养人DPSCs,流式细胞术检测其表面分子标志表达,阿利新蓝、茜素红及油红O染色检测其成软骨、成骨和成脂分化能力。ALP活性、ALP染色和茜素红染色观察LIPUS促成骨分化的能力。实时定量PCR检测LIPUS处理组与对照组成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2表达的差异以及不同时间点两组Trpm7 m RNA表达水平的变化。ALP活性检测LIPUS及不同浓度Trpm7抑制剂2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)对成骨分化能力的影响。实验分为对照组、LIPUS组、LIPUS+二甲基亚砜(DMSO)组和LIPUS+2-APB组,ALP和茜素红染色观察各组成骨分化能力,Western blot检测各组OPN、OCN和RUNX2的蛋白表达。结果显示,成功培养DPSCs,LIPUS处理后ALP和茜素红阳性染色明显增多,ALP活性增强(P<0.01);OPN、OCN、RUNX2的m RNA表达水平显著增加(P<0.05),LIPUS处理第2天和第5天Trpm7的m RNA表达水平有明显升高(P<0.05)。2-APB作用后明显下调ALP活性(P<0.01)。LIPUS组、LIPUS+DMSO组与对照组相比,ALP和茜素红阳性染色以及OPN、OCN与RUNX2的蛋白表达均显著增加,而LIPUS+2-APB组较于LIPUS+DMSO组,ALP和茜素红染色以及OPN、OCN与RUNX2的蛋白表达明显降低。该研究结果提示,LIPUS能够促进DPSCs的成骨分化,且Trpm7在这一过程中发挥着重要作用。