假病毒中和试验对狂犬病毒中和抗体效价的检测效能分析

目的:组织不同的实验室分析假病毒中和法(Pseudo Virus-based Neutralization Assay,PBNA)对不同样品的狂犬病病毒中和抗体水平的检测能力,并比较其与经典的快速免疫荧光灶抑制试验(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test,RFFIT)以及小鼠中和试验法(Mouse Neutralization Test,MNT)的相关性。方法:共9家实验室,分别采用PBNA、RFFIT以及MNT法对6份样品进行狂犬病病毒中和抗体检测,每个实验室进行3~5次重复实验。采用配对t检验及Pearson相关系数对3种检测方法的结果进行统计学分析。结果:PBNA与RFFIT、PBNA与MNT、RFFIT与MNT Pearson相关系数分别为0.985、0.988和0.974,抗体几何平均滴度进行t检验,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:3种方法重复检测6份样品的定量结果具有高度的相关性,PBNA法可作为《中华人民共和国药典》方法RFFIT、MNT的一种替代或补充方法,用于人用狂犬病疫苗临床血清、狂犬病人免疫球蛋白及抗狂犬病血清的狂犬病病毒中和抗体效价检测。

猪伪狂犬病毒抗体检测方法的研究进展

伪狂犬病,也称阿氏病(Aujeszky'sdisease),是由伪狂犬病毒(PRV)引起的一种高度传染性疾病。在没有特定宿主的情况下,伪狂犬病毒可以侵入多种哺乳动物,包括猪、牛、羊等,从而导致易感动物发生严重的临床症状和急性死亡。我国于20世纪50年代首次报道猪伪狂犬病,且自2011年以来,部分地区出现新的猪伪狂犬病变异株,致使养猪业遭受严重的经济损失。尽管科学家们一直在致力于诊断方法的设计和相关疫苗的开发,但伪狂犬病仍在养猪业广泛存在,近些年发现其对人类的健康也存在着潜在威胁,从而引起了世界范围内的强烈关注。目前我国的猪场普遍实行伪狂犬疫苗免疫,因此检测免疫后疫苗产生的抗体水平至关重要。本文总结目前对PRV的抗体检测方法,针对其优缺点进行对比分析,以对猪场临床上选择抗体检测方法提供参考。

两种狂犬病毒IgG抗体检测试剂盒的比较

目的了解员工暴露前接种人用狂犬病疫苗后的免疫效果,并对比使用两种不同试剂盒检测抗体阳转率是否存在差异。方法采集员工接种人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)以及冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)共计172例,分别使用两种狂犬病毒抗体检测试剂盒(试剂盒A、B)进行检测,统计血清中狂犬病毒Ig G抗体的水平,计算阳转率并比较差异。结果使用试剂盒A检测接种人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)者血清样本的阳转率为91.7%,接种冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)者血清样本的阳转率为51.0%;使用试剂盒B检测接种人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)者血清样本的阳转率为100.0%,接种冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)者血清样本的阳转率为74.5%。使用试剂盒B检测接种人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)者血清样本的阳转率比试剂盒A高8.3%,使用试剂盒B检测接种冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)者血清样本的阳转率比试剂盒A高23.5%。结论两种不同试剂盒上检测的抗体阳转率都反映出人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)比冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的免疫效果好;使用两种不同试剂盒检测抗体阳转率的差异均具有统计学意义。

RFFIT和MNT检测抗狂犬病毒中和抗体的比较研究

目的对RFFIT和MNT两种方法检测抗狂犬病毒中和抗体的相关性,敏感性和重复性进行比较。方法用MNT和RFFIT两种方法来检测已免疫的人血清52份,未免疫的人血清40份。结果显示这两种方法检测已免疫血清的一致性是88.5%,其相关性是r=0.886,MNT的敏感性和特异性分别是84.9%,100%;RFFIT的灵敏度和特异性分别是100%,89.0%。MNT和RFFIT重复检测一个样品的变异系数(CV)分别是62.3%、13.3%。结论RFFIT与MNT的相关性较好,RFFIT的灵敏度和重复性均比MNT好,因此,RFFIT在大多数需要检测RV中和抗体的情况下可替代MNT。

酶标法测定人血清中狂犬病毒IgG抗体的不确定度分析

目的规范酶标法测定人血清中狂犬病毒IgG抗体的不确定度分析程序,以期使不确定度评定更合理,更好地保证检测质量。方法采用酶标法在酶标仪上测定样本的OD值,测定1个月,据此原理建立数学模型,进行酶标仪测定人血清中狂犬病毒IgG抗体的A类不确定度分析。结果人血清中狂犬病毒IgG抗体的扩展不确定度U95=0.0064A(Veff=8)。结论在检测过程中带入不确定度的分析和使用有助于检验报告的完善,有助于检测质量的保证。

人源抗狂犬病毒单链抗体库的构建及体外亲和筛选

目的 :构建人源噬菌体展示单链抗体 (scFv)库 ,筛选抗狂犬病毒特异性、高亲和力的scFv。方法 :应用重组噬菌体抗体技术 ,从经狂犬病毒WISTARPM株疫苗免疫者的外周血淋巴细胞中 ,分离并构建scFv基因。将其克隆入噬粒载体pCANTAB 5E中 ,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K0 7援救构建噬菌体单链抗体库。采用狂犬病毒Vero疫苗亲和富集法 ,淘选阳性重组噬菌体 ,经鉴定后对其进行序列分析。用竞争ELISA ,初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。结果 :成功地构建了库容量约为 7× 10 8抗狂犬病毒噬菌体scFv库 ,筛选到 1株新的抗狂犬病毒的scFv S12。结论 :噬菌体展示scFv库的成功构建及人源抗狂犬病毒特异性scFv的获得 ,为进一步研制抗狂犬病毒的高特异性。

猪伪狂犬病毒gB、gC和gD蛋白多抗制备及交叉中和抗体效价测定

为研究猪伪狂犬病毒（PRv）主要免疫原性基因的抗原变异情况，本研究构建了PRV变异株JS-2012和弱毒疫苗株Bartha—K61的gB、gc和gD基因重组真核表达质粒。通过基因枪途径免疫新西兰大白兔，对制备的兔源多克隆抗体进行交叉中和抗体效价的i／n,4定。结果显示，JS．2012和Bartha．K61株的gC蛋白和gD蛋白多抗对PRVJS．2012变异株、SC经典强毒株和Bartha．K61弱毒疫苗株的交叉中和效价均无显著差异；而两个病毒株的2B蛋白多抗对JS．2012和sc株的中和效价较低，分别为1：29．0～56．7和1：56．2～137．0，对Bartha—K61株以及其他毒力基因缺失弱毒疫苗株的中和效价较高，分别为1：75．0--490．0和1：198．6～986．9，差异显著，推测该结果可能与PRV毒力基因缺失有关。本研究为进一步鉴定PRV流行株的抗原变异奠定基础。

伪狂犬病毒单克隆抗体的特性和应用

应用4株伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PrV)作免疫原,建立了23株分泌抗PrV的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。根据其免疫生物学特性可分为4个类型:(1)具有FA、ELISA和Western blot特性;(2)具有FA和ELISA特性;(3)具有FA和Western blot特性;(4)只有FA特性。根据ELISA和Western blot试验,McAb可将5株PrV分为两种不同的抗原群。应用此McAb建立并比较了3种检测PrV抗原的方法(FA、RPHA、ELISA)。FA和RPHA特异性强,与分离病毒的符合率分别为88.2％和76.5％。两者的阳性检测率统计学上无显著差异(P>0.05)。RPHA设备简单,操作简便,结果直观,更适于在基层单位推广应用。

生猪伪狂犬病毒gB抗体与中和抗体的相关性分析

为探索生猪伪狂犬病毒gB–ELISA抗体水平的高低与中和抗体效价的相关性,运用酶联免疫吸附测定(ELISA)法对177份生猪血清进行了伪狂犬病毒gB抗体的检测,同时,用中和试验对上述血清样品进行了伪狂犬病毒中和抗体的测定。试验结果通过生物统计学分析,gE抗体阴性血清的g B抗体平均S/P值和中和抗体效价(SN效价)倒数平均值的相关系数为0.926,说明g B免疫抗体S/P值与其中和抗体效价有很好的相关性。中和抗体水平的高低一般与免疫保护力呈正相关,研究结果表明gB–ELISA抗体水平可以用来评估生猪对当前流行PRV毒株的相对免疫保护力。

抗狂犬病毒核蛋白荧光标记抗体的制备和初步鉴定

目的 建立抗狂犬病毒 (RV)核蛋白 (NP)荧光标记抗体的制备方法并进行初步鉴定。方法 采用两种方法制备该试剂 :1 从RV感染的细胞中提纯RV核糖核蛋白 (RNP)作抗原 ,免疫动物然后制备荧光标记抗体 ;2 直接用本室原制备的 4株抗RV NP的单克隆抗体混合进行标记。结果 制备的试剂有较高的敏感性和特异性 ,经与法国巴斯德诊断用品公司的相应产品进行比较 ,所得结果的符合率为 10 0 %。特别是用后一种方法制备的试剂优点更多。结论 该制品可替代进口产品 。

从半合成噬菌体抗体库筛选抗狂犬病毒人单链抗体

目的 应用纯化的狂犬病毒抗原从半合成噬菌体抗体库中筛选针对狂犬病毒的人单链抗体(ScFv)。方法 用固相化的狂犬病毒抗原对半合成抗体库进行 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,从第 3轮洗脱下来的克隆中获得一株有可溶性表达且特异性结合狂犬病毒抗原的ScFv ,并进行基因序列测定。结果 所获氨基酸序列经blast数据库搜索 ,与一种抗狂犬病毒免疫球蛋白的氨基酸序列同源性最高 ( 82 % )。经检索kabat数据库 ,发现其轻、重链可变区分别属于VkⅠ型、VHⅢ型。结论 从噬菌体抗体库可以方便快捷地分离到针对狂犬病毒的单链抗体 。

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。

胶体金免疫层析检测犬、猫抗狂犬病病毒IgG抗体的研究

目的建立检测犬、猫抗狂犬病病毒(RV)IgG抗体的胶体金免疫层析方法。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金用以标记SPA,同时将重组RVN蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,制备一种检测犬、猫抗RVIgG抗体的胶体金检测卡,进行了特异性和灵敏度试验,并与ELISA同时检测临床样品、统计结果。结果 GICA试纸条检测灵敏度为0.5IU/mL,与犬瘟热病毒、犬细小病毒等阳性血清无交叉反应,并与ELISA相比,两者的符合率为94.6%。结论成功建立了检测犬、猫抗RVIgG抗体的通用型胶体金免疫层析方法 ,该方法灵敏度高,特异性强,检测速度快,操作简便,可广泛应用于基层。

检测犬源狂犬病毒中和抗体ELISA方法的建立

为了有效监测犬免疫狂犬病疫苗后的保护效力,以狂犬病毒(Rabies virus,RV)糖蛋白的主要优势抗原表位区G3蛋白(RV G3)作为包被抗原,建立了一种检测狂犬病毒中和抗体效价的间接ELISA方法.通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量为8 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶3 000.特异性试验表明,该抗原不与犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒阳性血清发生交叉反应;批内和批间重复性试验的平均变异系数都小于10%;敏感性达1∶1 280.此方法检测134份血清样品的结果与美国SYNBIOTICS试剂盒相比,总符合率达95.6%.

人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体的生物学特性研究

对抗狂犬病毒scFv进行稳定性改构 ,纯化制备有活性的人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段 (dsFv) ,然后对其生物学活性进行研究。将dsFvVH 、VL 基因在原核表达系统pET2 2b(+) BL2 1(DE3)中表达 ,将其包涵体分别在变性缓冲液中溶解 ,稀释后加入折叠缓冲液使其折叠形成有活性的dsFv抗体片段 ,上Ni NTA柱进行纯化。然后以其亲本scFv作为对照 ,对dsFv的亲和力、稳定性以及体外中和活性进行评价。结果显示 ,与其母本抗体scFv相比 ,改构后的抗狂犬病毒dsFv保持了对狂犬病毒Vero疫苗的特异性识别能力 ,而且其亲和力明显提高 ;抗狂犬病毒dsFv在血清和BSA中的稳定性有明显的改进 ,而且其热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大大改进 ;蚀斑减少中和实验显示 ,抗狂犬病毒dsFv抗体片段能特异中和狂犬病毒 ,阻止狂犬病毒对Vero细胞的吸附 ,抑制狂犬病毒对靶细胞的感染 ,从而导致蚀斑减少甚至消失 ;scFv抗体片段仅可部分抑制蚀斑的形成 ,但不能全部抑制。这为进一步研究抗狂犬病毒dsFv基因工程抗体的免疫保护作用及其在临床的应用奠定了基础。

应用间接混合夹心酶免疫试验法检测人血清中狂犬病毒抗体

本文利用狂犬病毒单抗，结合间接ＥＬＩＳＡ，建立了一种检测狂犬病毒抗体的间接混合夹心酶免疫试验法。以此方法检测６０份人血清样品，与常规的小鼠中和试验法测得结果相比较，二者相关性显著（ｒ＝０．９２６）。实验证明，此法特异性强、灵敏度高、稳定性好，且省去了间接ＥＬＩＳＡ的抗原提纯等步骤，操作简单，适合于发展成为诊断试剂盒。

犬狂犬病毒抗体ELISA检测方法的建立

目的建立犬狂犬病毒抗体ELISA检测方法。方法采用RV-CTN株感染Vero细胞制备狂犬病毒抗原,并经浓缩和纯化后,分别建立间接ELISA和竞争ELISA方法。结果经初步质量鉴定,特异性10份阳性,20份阴性,符合率均达100%,间接ELISA的灵敏度达1∶640,竞争ELISA达1∶32;间接ELISA的精密性(变异系数CV)为6.98%,竞争ELISA为5.10%。结论建立了用间接ELISA检测抗狂犬病毒IgG抗体和竞争ELISA检测抗狂犬病毒总抗体的方法,并生产出相应试剂盒。

人源抗狂犬病毒单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达

以人源抗狂犬病毒糖蛋白母本单链抗体ScFv为模板,利用PCR点突变分别在重链FR可变区VH(44)和轻链FR可变区VL(100)分别引入一个半胱氨酸,成功构建了重组单链二硫键稳定抗体基因。连接pET22b(+)载体,转化入E.coli BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。体外复性并经Ni-NTA亲和层析对目的蛋白ScdsFv进行纯化;利用荧光抗体实验和ELISA检测抗体活性及稳定性。结果表明重组ScdsFv蛋白实现了原核高效表达,通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度大于90%的ScdsFv蛋白。荧光抗体实验和ELISA结果表明ScdsFv具有特异的抗原结合活性,与母本ScFv比较,稳定性有明显提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定ScdsFv蛋白的获得为其进一步的功能研究提供了材料。

人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的表达和鉴定

目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测。方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,用快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测表达产物的中和活性。结果Western blot显示表达产物与抗C-myc抗体在相对分子质量约30 000处出现强阳性表达带。FACS表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染的Vero细胞出现特异性反应。RFFIT表明,A12 ScFv在1∶27倍稀释时能完全中和病毒。结论已获得了A12可溶性表达,表达产物能与狂犬病毒G蛋白特异性结合,并对狂犬病毒具有一定的中和活性。