人生存素T34A重组腺病毒载体的构建、鉴定和体外表达

目的:采用高效简便的GatewayTM系统构建人生存素T34A基因重组腺病毒载体(Ad-hSurvivinT34A)。方法:从pORF9-hSurvivinT34A质粒中克隆人生存素T34A基因,经NcoⅠ/XhoⅠ双酶切后插入到入门载体pEN-TR11的attL1和attL2之间,形成入门克隆;在高效重组酶的作用下,入门克隆与带attR1和attR2位点的病毒骨架载体Ad/CMV/V5-DEST发生体外同源重组,形成表达克隆Ad-hSurvivinT34A。鉴定正确后将其线性化,由Lipo-fectamine2000介导转染293细胞进行病毒包装,收集病毒上清。采用western Blot检测病毒感染的人宫颈癌细胞株Hela细胞中人生存素T34A蛋白的表达。结果:成功构建了人生存素T34A基因的重组腺病毒,该病毒能在细胞中高效表达。结论:本实验利用GatewayTM系统成功构建了Ad-hSurvivinT34A,与传统的腺病毒构建方法相比,更简便和高效,为下一步利用人生存素T34A进行肿瘤免疫基因治疗奠定实验基础。