靶向融合防龋DNA疫苗免疫田鼠的实验研究

目的 :以定菌田鼠为动物模型 ,经不同免疫途径 ,比较 3种防龋DNA疫苗 [pGLUA -P(以 pCI为载体 ) ,pGJA -P(以 pCI为载体 ) ,pGJA -P(以 pVAX为载体 ) ]的免疫防龋效果。 方法 :将 96只田鼠随机分为 12组 ,接种变形链球菌并给予致龋饲料 ,按 6因素 (3种质粒 ,2种空载体 ,生理盐水 ) 2水平 (肌肉 ,粘膜途径 )析因设计方案免疫田鼠 ,采用ELISA方法检测各组田鼠血清IgG和唾液IgA水平 ,参照Keyes经典计分标准进行龋齿计分 ,观察各组田鼠磨牙患龋情况和一般安全性指标。结果 :疫苗免疫组特异性抗Pac血清IgG和唾液IgA抗体水平均显著高于非疫苗免疫组 (P <0 .0 1) ,而龋齿记分显著低于非疫苗免疫组 (P <0 .0 1)。同一接种途径中 ,不同质粒刺激机体产生的抗体水平不同 ,同种质粒 ,经不同途径接种诱导机体产生抗体水平也不同 ,其中以鼻粘膜免疫接种pGJA-P(以 pCI为载体 ) ,pGJA -P(以pVAX为载体 )组的唾液抗Pac的sIgA水平高 ,龋齿记分低 ,与其它实验组比较差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论 :靶向融合防龋DNA疫苗能够激发机体产生免疫反应 ,经粘膜免疫可诱导较高的唾液抗Pac的sIgA ,并且有效的控制龋齿的发生和发展。

特异性靶向犬细小病毒融合DNA疫苗的构建及免疫效果的研究

研究旨在构建特异性靶向犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)融合DNA疫苗,探讨其诱导机体产生免疫应答的效果。试验用重组技术构建了含细胞毒性T淋巴细胞抗原-4胞外区(CTLA-4125)与犬细小病毒VP2的主要抗原表位区域(VP2_(228))融合表达质粒pVAX1-CTLA-4125-VP2_(228),同时构建了不含CTLA-4125的pVAX1-VP2_(228),体外转染COS-7细胞,Western blotting检测其表达产物;将pVAX1-CTLA-4125-VP2_(228)、pVAX1-VP2_(228)分别免疫小鼠,免疫后进行抗体水平测定和抗体亚型分析;通过淋巴细胞增殖试验和ELISA分别检测淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素表达水平。结果显示成功构建了pVAX1-CTLA-4125-VP2_(228)和pVAX1-VP2_(228),并能在COS-7细胞中正确表达;抗体检测结果显示pVAX1-CTLA-4125-VP2_(228)免疫组抗体水平显著高于pVAX1-VP2_(228)免疫组(P<0.05);淋巴细胞增殖试验显示pVAX1-CTLA-4125-VP2_(228)免疫组的刺激指数显著高于pVAX1-VP2_(228)免疫组(P<0.05);γ-干扰素表达水平测定显示pVAX1-CTLA-4125-VP2_(228)免疫组极显著高于pVAX1-VP2_(228)免疫组(P<0.01)。结果表明,CTLA-4125-VP2_(228)融合DNA能有效增强动物对VP2_(228)抗原的免疫应答,为进一步研究融合DNA疫苗特异性的靶向递呈机制奠定基础。

防龋DNA疫苗免疫效能评价中间接ELISA检测的建立和验证

目的:建立血清样本特异性抗体检测的间接ELISA方法,应用于龋齿DNA疫苗特异性抗体效力检测。方法:通过棋盘滴定确定样本检测条件建立血清特异性抗PAc抗体间接ELISA方法,并对所建立的方法进行特异性和精密度验证。结果:确定包被PAc蛋白浓度为10mg/L,酶标抗体工作浓度1∶5000,样本稀释倍数1∶200。方法的重复性检测表明,板间和板内误差小于15%;中间精密度高、中、低3个浓度的CV值小于15%。结论:该方法特异性强,具有良好的重复性和中间精密度,可用于防龋DNA疫苗免疫效能评价中血清样本特异性抗PAc抗体的检测。

特异性靶向的戊肝嵌合DNA疫苗的构建及免疫效果研究

目的 制备特异性靶向的嵌合DNA疫苗，并探讨其诱导机体产生免疫应答的效果。方法 用基因重组技术构建细胞毒T淋巴细胞抗原4（CTLA4）与戊肝病毒抗原HEVE2嵌合基因的真核表达质粒。同时构建不带CTLA4的pHEVE2作为平行对照质粒，体外转染COS-7细胞，Western blotting法检测细胞培养上清表达并且 物；于BALB/c小鼠皮内注射，每隔2周1次，共免疫3次，100μg/次，于免疫的第3、5和10周ELISA检测抗体效价。结果 获得pHEVE2和pCTLA4-HEVE2嵌合基因真核表达质粒，测序证实各连接点阅读框序列正确；体外转染COS-7细胞，证明真核质粒以分泌形式表达；接种pCTLA4-HEVE2小鼠产生高滴度的特异性抗HEVE2抗体，比接种pHEVE2的对照组高50-100倍；pCTLA4-HEVE2诱导高水平的IgG2a,IgG2bTh1型抗体和IgG1Th2型抗体应答，pHEVE2则以IgG1Th2型抗体应答为主。结论 CTLA4-HEVE2嵌合DNA疫苗有效地增强动物对HEVE2抗原的免疫应答，为进一步研究抗原靶向性的嵌合DNA疫苗奠定基础。

DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB/c小鼠实验研究

目的观察编码PAc结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法将25只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论重组质粒pCIA-P是一种有效的免疫原,该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。

中试防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX免疫小鼠的实验研究

目的:评价中试防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX诱导小鼠体内特异性免疫应答的效果。方法:分别由武汉生物制品研究所中试制备和实验室采用德国Qiagen公司去内毒素质粒大量提取试剂盒手工提取防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX;两种方法制备的质粒分别于0周,2周经肌肉、鼻腔免疫小鼠,并以鞭毛蛋白作为黏膜佐剂与质粒同时经鼻腔免疫小鼠,PBS及空载体pVAX1作为对照。免疫前开始每两周收集小鼠血清和唾液样本,ELISA定量检测血清及唾液中特异性抗体含量。结果:中试质粒和手提质粒肌注时均能够诱导血清特异性IgG,但诱导唾液特异性sIgA的能力较为有限。在与黏膜佐剂鞭毛蛋白同时滴鼻时,中试质粒可诱导较为明显的血清特异性IgG和唾液特异性sIgA。在相同的免疫条件下,中试质粒诱导的特异性抗体水平低于手提质粒组,但二者无显著性差异。结论:中试防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX能够诱导小鼠体内特异性体液免疫应答。

免疫防龋DNA疫苗动物实验研究进展

龋病是以变形链球菌为主要致龋菌引起的口腔感染性疾病。有效地诱导机体产生针对变形链球菌的系统免疫和黏膜免疫,阻止细菌在牙面的粘附与聚集以及细菌在口腔内定植,是防止致龋菌感染的有效手段。应用于免疫防龋研究主要有主动免疫防龋和被动免疫防龋。本文主要论述主动免疫防龋疫苗中的防龋DNA疫苗的优缺点、研究进展及未来的发展前景。

DC靶向适配体修饰的载铜绿假单胞菌DNA疫苗递送系统的构建及体外评价

构建了一种DC靶向适配体修饰的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)DNA疫苗递送系统。采用乙醇注入法制备阳离子脂质体,静电吸附法制备载pVAX1-OprF-VP22的阳离子脂质体(Lip-pOprF-VP22),探讨不同DOTAP/pDNA质量比的Lip-pOprF-VP22对pVAX1-OprF-VP22的包封效果、对DC2.4的细胞毒性及转染率,筛选最佳质量比的Lip-pOprF-VP22测定其粒径及Zeta电位;后插法制备DC靶向适配体修饰的载pVAX1-OprF-VP22的阳离子脂质体(Apt-Lip-pOprF-VP22),检测其转染DC2.4后OprF蛋白的表达量及对小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)成熟的影响。结果表明,Lip-pOprF-VP22随着DOTAP/pDNA质量比增加包封率逐渐增加,当质量比为5∶1时即能很好的包封pVAX1-OprF-VP22;当Lip-pOprF-VP22作用于DC2.4 24 h或48 h后,不同质量比的Lip-pOprF-VP22对DC2.4的存活率均在80%以上;当DOTAP/pDNA质量比由2∶1增加到10∶1,转染率表现为先增加、后降低的趋势,其中DOTAP/pDNA质量比为4∶1、5∶1时转染率相对较高;当DOTAP/pDNA质量比为5∶1时,Lip-pOprF-VP22粒径为(171.67±1.27)nm,Zeta电位为(11.30±0.57)mV;Apt-Lip-pOprF-VP22转染DC2.4后可表达更多OprF蛋白且可明显促进BMDCs的成熟。

一种鸡球虫DNA疫苗的生物安全性评价

将一种鸡球虫DNA疫苗以剂量30μg/羽,经肌肉注射免疫1日龄雏鸡1次;以剂量30μg/羽,于7日龄、14日龄、21日龄分别经肌肉注射免疫雏鸡3次;以剂量80μg/羽,将不同时间制备地3批疫苗,分别经肌肉注射于14日龄雏鸡。分5次于免疫后每个月采取血液、心、肝、脾、肾和注射部位组织,用PCR技术检测质粒DNA在各个组织的残留情况;同时制备石蜡切片,观察上述组织有无病理变化。结果表明,疫苗免疫后的第1个月在被检组织中都能检测到质粒DNA的存在,随着时间的推移,所检测到质粒的浓度逐渐减少,免疫4个月之后,所有组织都检测不到质粒DNA存在,可推断质粒DNA并未整合入动物细胞基因组;同时组织也未发现病理学变化。认为该DNA疫苗对靶动物是安全的。

DNA改组及其在疫苗研制中的应用

DNA改组 (DNAshuffling)是上世纪 90年代中期发展起来的一种全新的分子水平上的人工定向进化技术。它模拟自然界进化的机制 ,改变了传统的进化途径 ,通过体外重组来改造靶基因 ,并定向筛选具有预期性状的突变体 ,从而大大加速了蛋白质的进化进程。该技术自建立以来 ,已在生物工程各领域得到了越来越广泛的应用。本文总结了DNA改组的基本原理、技术路线、特点、改进与发展 ,并综述了其在疫苗研制方面的研究进展。

小鼠卵透明带3(mZP3) cDNA的克隆、测序及mZP3 DNA疫苗的构建

卵透明带 3 (ZP3 )蛋白是透明带中的一种主要蛋白 ,在精卵结合过程中作为精子的初级受体起重要的作用 ,抗 ZP3抗体可以阻断精卵的相互作用 ,ZP3被认为是一种潜在的避孕疫苗的靶抗原。本文根据小鼠卵透明带(m ZP3 ) c DNA序列 (1 3 1 7bp)设计了上游和下游引物 ,从小鼠卵巢中提取总 RNA,经 RT-PCR克隆了鼠卵透明带 3基因的 c DNA,将其亚克隆至 p UCm-T载体后利用蓝白斑特性筛选出阳性克隆 ,酶切鉴定后测序比较 ,与Gene Bank小鼠 ZP3 c DNA序列完全相同 ,证明克隆出正确的小鼠 ZP3 c DNA.将 m ZP3克隆至真核表达质粒p CMV4上 ,构建完成了 DNA避孕疫苗的载体 p CMV4-m ZP3 ,为应用

基因释放剂在制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板中的应用

目的 :探讨基因释放剂的应用并为结核病DNA疫苗的研究提供靶基因。方法 :分别用基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板 ,采用PCR法从模板中扩增早期分泌性抗原靶 (ESAT - 6 )基因并测序证实所扩增的基因是否为目的基因。结果 :从基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备的DNA模板中均成功地扩增出了目的基因ESAT - 6。结论 :基因释放剂提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板方便、快捷 ,提高了制备DNA模板效率。

基因重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗的研究Ⅰ.变形链球菌pac基因上游区序列测定和分析

目的 :对变形链球菌表面蛋白 pac基因上游区进行序列测定和分析。方法 :通过应用 PCR测序试剂盒和DNA自动测序仪 ABI3 10对变形链球菌表面蛋白 pac基因上游区进行序列测定。结果 :测定了 pac基因上游区内的5 17个碱基序列。结论 :变形链球菌表面蛋白 pac基因上游区序列测定为基因重组鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗的研究提供了基础资料。

嵌合DNA疫苗HSP70的研究进展

分子伴侣热休克蛋白70(HSP70)具有明显的免疫佐剂效应,进化保守,无种属靶向特异性,作为免疫优势抗原可诱导体液和细胞免疫,提高嵌合DNA疫苗的免疫效果。大量研究表明嵌合DNA疫苗HSP70是最有希望的新疫苗之一。

DC-SIGN靶向的载铜绿假单胞菌DNA疫苗纳米粒的构建及免疫效力评价

目的构建一种靶向树突状细胞(dendritic cells,DC)乳-N-岩藻糖戊糖(lacto-N-fucopentoseⅢ,Lewis X)修饰的载铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PcrV和OprF联合DNA疫苗的PLGA纳米粒,为预防PA临床感染提供新思路。方法利用双乳化-溶剂挥发法制备载PcrV和OprF联合DNA的PLGA纳米粒(PLGA+PcrV/OprF)或载pEGFP的PLGA纳米粒(PLGA+pEGFP);在此基础上,利用酰胺缩合反应将DC-SIGN靶向配体Lewis X连接至PLGA纳米粒表面,制备Lewis X修饰的PLGA+PcrV/OprF(Lewis X-PLGA+PcrV/OprF)、Lewis X修饰的PLGA-pEGFP(Lewis X-PLGA+pEGFP);以水化直径、Zeta电位、包封率与载药量为指标对Lewis X-PLGA+PcrV/OprF进行表征分析;用CCK-8考察其细胞毒性;通过Lewis X-PLGA+pEGFP体外转染进行DC靶向验证;进一步通过Lewis X-PLGA+PcrV/OprF溶酶体逃逸评价Lewis X修饰的携载DNA的PLGA纳米粒的体外靶向性能;通过检测该纳米粒的淋巴细胞增殖水平、体液免疫水平和免疫保护水平,评价其免疫效力。结果制备的Lewis X-PLGA+PcrV/OprF水化直径为(201.17±1.6)nm,包封率为(85.72±5.3)%,Zeta电位为+(31.17±1.8)mV;Lewis X-PLGA+PcrV/OprF在DC2.4中的细胞毒性试验显示细胞存活率均在85%以上;荧光显微镜观察Lewis X-PLGA+pEGFP体外转染结果表明,DC2.4更能摄取表达Lewis X-PLGA+pEGFP,具有DC-SIGN特异性靶向性能;激光共聚焦观察溶酶体逃逸结果表明,Lewis X-PLGA+PcrV/OprF发生溶酶体逃逸后有更多的DNA进入细胞质;体内免疫结果显示,靶向DNA疫苗的淋巴细胞增殖水平和抗体滴度水平显著增加,进一步提高了感染急性肺炎小鼠的生存率,减少了小鼠肺部细菌负荷。结论成功构建DC-SIGN靶向的载PA DNA疫苗纳米粒Lewis X-PLGA;促进了其携载的DNA转染进入DC;促进了更多PA DNA疫苗内吞进入DC溶酶体,逃逸出更多PA DNA至细胞质,从而引起体内显著的免疫应答,增强了疫苗保护效力。