重组人甲状旁腺素(1-34)诱导过表达EGFR的角质形成细胞中差异表达转录因子的筛选

目的利用转录组测序技术,筛选重组人甲状旁腺素(1-34)[rhPTH(1-34)]影响角质形成细胞(KC)内表皮生长因子受体(EGFR)表达的差异转录因子,以探讨rhPTH(1-34)治疗银屑病的机制。方法慢病毒转染培养的HaCaT细胞,使之过表达EGFR。rhPTH(1-34)组加入0.01μmol/L rhPTH(1-34),空白组加入等量DMEM溶液。抽提两组细胞RNA,用紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳法进行RNA产量和质量检测。合成cDNA,实时定量PCR扩增,对文库有效浓度进行准确定量。上机测序,对所得数据进行处理和分析。用DESeq2软件分析两组数据之间的差异,以|log_2foldchange|≥1且P<0.05作为筛选条件对测序结果进行分析。结果rhPTH(1-34)组和空白组共表达的基因数目12455个,rhPTH(1-34)组单独表达421个,空白组单独表达461个。rhPTH(1-34)组与空白组比较,差异基因共185个,其中108个上调,77个下调。下调中,|log_2foldchange|最高的5个差异转录因子为ZNF525、ZNF774、ZNF576、ZBTB42和POU4F1(P<0.05)。其中ZNF774、POU4F1主要涉及Notch2、MAPK信号通路的调节。结论rhPTH(1-34)抑制KC增殖可能与下调ZNF525、ZNF774、ZNF576、ZBTB42、POU4F1表达有关。其中ZNF774、POU4F1可能与KC增殖相关。

注射用重组人甲状旁腺素(1-34)的Ⅰ期临床耐受性研究

目的:评价中国健康志愿者皮下注射重组人甲状旁腺素(1-34)的安全性和耐受性。方法:将40例18～40岁的健康受试者随机分为10,20和40μg 3个剂量组,腹部皮下注射,观察临床症状体征并严密观察记录试验期间发生的不良反应事件。结果:各组受试者体检及实验室检查各项指标均在正常范围,具较好的可比性。给药后生命体征和实验室检查均未见有临床意义的改变,试验中未见严重不良反应发生。结论:健康受试者皮下注射甲状旁腺素(1-34)40μg以内安全性和耐受性较好。

人甲状旁腺素(1-34)的合成与聚乙二醇化修饰

目的合成人甲状旁腺素(1 34) [hPTH(1-34) ]并进行聚乙二醇化修饰。方法应用固相多肽合成方法合成并经高效液相色谱纯化得hPTH(1-34) ,Cys-hPTH(1- 34)和hPTH(1-34)-Cys-NH2 。Cys hPTH(1-34)和hPTH(1-34)-Cys-NH2 在水溶液(pH 7～8)中分别与平均相对分子质量为5 0 0 0的单甲氧基马来酰亚胺基聚乙二醇(mPEG50 0 0 MAL)反应,经高效液相色谱纯化得Cys(mPEG50 0 0 MAL)- hPTH(1-34)和hPTH(1-34)-Cys(mPEG50 0 0- MAL) -NH2 。结果hPTH(1-34) ,Cys(mPEG50 0 0 MAL) hPTH(1 34)和hPTH(1 34) Cys(mPEG50 0 0 MAL) NH2 的质谱和氨基酸组成分析结果均与理论值一致。hPTH(1-34) -Cys(mPEG50 0 0-MAL) NH2 保持了较好的体外活性,Cys(mPEG50 0 0- MAL) hPTH(1-34)保持了较好的体内活性。结论采用一种简便的方法成功实现了对hPTH(1-34)

肽图分析在重组人甲状旁腺素1-34产品质量控制中的应用

目的通过肽图谱分析,鉴定重组人甲状旁腺素1-34产品一级结构的完整性和准确性。方法采用胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法测定肽图;用LC-MS/MS和N端氨基酸测序鉴定产品氨基酸序列。结果建立重组人甲状旁腺素1-34产品肽图测定法,并鉴定出肽图异常产品的氨基酸序列。结论肽图分析能有效地控制重组人甲状旁腺素1-34产品一级结构的完整性和准确性,对该产品的质量控制具有重要意义。

人甲状旁腺素(1-34)对新生大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性影响

目的：研究外源性ｈＰＴＨ（１３４）对原代培养成骨细胞ＡＬＰ活性影响。方法：新生大鼠头盖骨中取成骨细胞，改良Ｇｏｍｏｒｉ氏钙钴法染色鉴定，磷酸苯二钠法测定ＡＬＰ活性，ＲＴＰＣＲ检测ＡＬＰｍＲＮＡ表达。结果：１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１ｈＰＴＨ（１３４）以４８ｈ为一循环，在每一循环的前１２ｈ作用于细胞时，可使成骨细胞ＡＬＰ活性较对照组增加最明显，ｈＰＴＨ（１３４）４８ｈ作用组，与对照相比细胞ＡＬＰ活性无显著差异。ｈＰＴＨ（１３４）１２ｈ作用组，成骨细胞ＡＬＰｍＲＮＡ表达最高。结论：ｈＰＴＨ（１３４）刺激成骨细胞内ＡＬＰ活性升高与给药方式及药物浓度有关，间歇性给药成骨细胞内ＡＬＰ活性升高。

注射用重组人甲状旁腺素(1-34)在健康人体的药代动力学

目的研究注射用重组人甲状旁腺素(1-34)[rhPTH(1-34)](激素)在中国健康人体内的药代动力学特征。方法30名健康受试者随机分为10,20,40μg3个剂量组,每组10人,用免疫放射测定法(IRMA)测定人血浆中甲状旁腺激素(PTH)浓度。结果药代动力学参数:tmax分别为(32.5±9.5),(24.0±9.7)和(35.0±13.5)min;Cmax分别为(0.14±0.04),(0.20±0.05)和(0.30±0.04)ng.mL-1;t1/2分别为(47.7±12.1),(50.1±16.4)和(53.6±14.4)min;AUC(0-240)分别为(9.79±1.46),(15.42±1.66)和(32.72±3.16)ng.min.mL-1。结论单次皮下注射重组人甲状旁腺素(1-34)在低、中、高3个剂量内,Cmax和AUC呈线性增长,与剂量呈正相关;体内代谢呈线性代谢特征,与国外报道基本一致。

重组人甲状旁腺素1-34治疗绝经后骨质疏松症的临床研究

目的观察重组人甲状旁腺素1-34(recombinant human parathyroid hormone 1-34)应用于绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)患者的临床疗效。方法筛选出68例绝经后骨质疏松症患者,所有患者入组后均口服元素钙500 mg/d和维生素D 200 U/d,连续服用26周后加用皮下注射重组人甲状旁腺素1-34(特立帕肽)20μg/d,再连续治疗26周,于应用特立帕肽治疗前及治疗后的13和26周测定腰椎(L_(1-4))和股骨近端骨密度(BMD),采静脉血测定血清骨钙素(OC)、碱性磷酸酶(AKP)水平,应用疼痛视觉模拟评分法(VAS评分)评价患者的疼痛程度,并记录不良反应情况。结果 68位患者均完成全疗程治疗。应用特立帕肽治疗13周时,腰椎L_(1-4)、股骨颈、大粗隆和股骨干骨密度改善不明显(P>0.05),血清骨钙素和碱性磷酸酶较治疗前升高(P<0.05),疼痛缓解明显(P<0.05);治疗26周时,腰椎L_(1-4)和股骨颈骨密度较治疗前明显增高(P<0.05),而大粗隆和股骨干骨密度改善不明显(P>0.05),血清骨钙素和碱性磷酸酶呈持续升高趋势(P<0.05),疼痛明显减轻(P<0.05)。治疗期间不良反应的情况均较轻微,没有给予特殊处理即自行缓解。结论连续26周使用重组人甲状旁腺素1-34能有效地促进患者骨形成,缓解骨质疏松症患者疼痛症状,提高患者腰椎、股骨骨密度。

重组人甲状旁腺素1-34胰蛋白酶切肽图谱分析

目的 :对重组人甲状旁腺素 1- 34进行肽图谱测定 ,以确证一级结构和比较不同批产品间一级结构的一致性。方法 :运用梯度洗脱 /反相高效液相色谱法对样品进行纯度检查和肽图谱测定。结果 :建立了重组人甲状旁腺素 1 -34的胰蛋白酶水解肽图谱HPLC测定方法 ,3批样品的肽图谱均与对照品一致。结论 :建立的肽图测定方法简便、准确、重现性好 ,适用于产品的质量控制。

人甲状旁腺素N端34肽基因的合成、克隆及融合表达

选用大肠杆菌偏爱的密码子,用计算机辅助设计、合成长度分别为59 、59 及60 碱基的三段寡核苷酸。以中段寡核苷酸为模板,两端寡核苷酸为引物,经PCR 合成完整的hPTH(134) 基因,并克隆到pUC18 载体中。对克隆基因进行序列分析,结果与设计的完全一致。将该基因与表达载体pKA 连接构建表达质粒pKAT,转化大肠杆菌JM105 细胞,SDSPAGE 表明hPTH(134) 融合蛋白获得了表达,并且酸水解后融合蛋白被裂解为大小两个片段。

重组人甲状旁腺素相关蛋白PTHrP1-86对骨质疏松大鼠治疗作用的实验研究

目的探讨重组人甲状旁腺素相关蛋白PTHrP1-86对骨质疏松大鼠的骨同化作用。方法用摘除大鼠双侧卵巢的方式制备骨质疏松模型(OVX),去势手术16周后,测定大鼠腰椎骨密度,确认动物模型造模成功。实验动物分为8个组,给药后测定骨密度、骨钙素、骨形态计量学、骨生物力学等指标,初步评价重组人甲状旁腺素相关蛋白PTHrP1-86对骨质疏松大鼠的骨同化作用。结果重组人甲状旁腺素相关蛋白PTHrP1-86可使骨转换加快,促进新骨生成,使骨的力学性能提高,抗弯曲强度提高,抗变形能力增强,韧性增高,脆性降低,不易发生断裂。结论PTHrP1-86能有效提高骨的抗骨折能力,对治疗和预防骨质疏松有一定疗效。同时证明该动物实验方法行之有效,可以很好地测定PTHrP对骨质疏松的治疗作用,并可以此为依据开始一期临床实验。

HPLC法测定重组人甲状旁腺素1-34肽含量及有关物质

目的:用高效液相色谱法测定重组人甲状旁腺素1-34原液和制剂的肽含量及有关物质。方法:采用 Zorbax 300SB-C_(18)色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以流动相 A:水-乙腈-三氟乙酸(990:10:1),流动相 B:水-乙腈-三氟乙酸(10:990:1)为流动相,梯度洗脱,流速1.0mL·min^(-1),检测波长215nm,柱温37℃。结果:重组人甲状旁腺素1-34浓度在26.25～841.5μg·mL^(-1)范围内,与峰面积的线性关系良好(r=0.9999),最低检测限为131ng,高、中、低3种浓度的平均回收率范围为99.5%～100.6%,RSD 为0.52%～0.72%(n=3)。结论:方法简便,快速,准确,可靠,可作为本品的质量控制方法。

重组人甲状旁腺素1-34对去卵巢大鼠骨质疏松的作用研究

目的探讨重组人甲状旁腺素1-34(hPTH1-34)对去卵巢大鼠骨质疏松的治疗作用。方法 50只7个月龄SD健康雌性大鼠,30只行双侧卵巢摘除术,20只做假手术(SHAM),12周后各处死10只证实骨质疏松造模成功。余20只双侧卵巢摘除大鼠随机分为去卵巢(OVX)安慰剂组10只和hPTH1-34治疗组10只,10只SHAM组作对照。hPTH1-34治疗组剂量为20μg/kg,皮下注射,每周注射3次。OVX安慰剂和SHAM组皮下注射0.5 mL生理盐水,每周注射3次。治疗3个月后,测定并比较三组股骨、腰椎骨密度(BMD)、血清钙、磷、骨源性碱性磷酸酶(BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(Trap-5b)水平。结果 hPTH1-34治疗组股骨和腰椎BMD较OVX安慰剂组明显升高[(0.151±0.008)g/cm2比(0.135±0.013)g/cm2,(0.181±0.010)g/cm2比(0.159±0.008)g/cm2,P<0.01],血清钙、磷、BALP、Trap-5b水平明显高于OVX安慰剂组(P<0.05或P<0.01),与SHAM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 hPTH1-34通过刺激成骨细胞的活性,抑制破骨细胞,可显著增加BMD,对去卵巢大鼠骨质疏松有效。

重组人甲状旁腺素(1-34)对绝经后骨质疏松症的治疗作用研究

目的评价重组人甲状旁腺素(1-34)治疗绝经后骨质疏松症的临床疗效和安全性。方法入选绝经后骨质疏松症患者50例,采用随机、开放、对照试验设计分为2组,试验组37例,每日皮下注射重组人甲状旁腺素(1-34)20μg,对照组13例,每周肌肉注射依降钙素(益盖宁)20U,所有患者均口服钙尔奇D600 0.6g/d,试验时间为6个月,观察患者治疗前后的骨密度变化、骨折发生情况,以及血尿常规、肝肾功、电解质、心电图改变等。结果试验组和对照组基线情况中,年龄、L1-L4骨密度、腰椎平均骨密度和大粗隆骨密度之间差异无统计学意义(P>0.05),试验组股骨颈骨密度显著高于对照组(P<0.05),Ward s区骨密度显著低于对照组(P<0.05);试验期间两组各有1例脱落;经过6个月治疗后,试验组与对照组相比,L2骨密度增加更显著(P<0.05),股骨颈骨密度增加次于对照组(P<0.05),Ward s区骨密度有所下降,显著低于对照组(P<0.05),其余各部位骨密度差异无统计学意义(P>0.05);试验组自身前后对比,L1、L2、L3、L4及腰椎平均骨密度增加显著(P<0.05),股骨颈及大粗隆骨密度有所增加,但差异无统计学意义(P>0.05),Ward s区骨密度有所降低,亦无统计学意义(P>0.05);对照组自身前后对比,L3及腰椎平均骨密度增加显著(P<0.05),L1、L2、L4、股骨颈及Ward s区骨密度有所增加,但无统计学意义(P>0.05);大粗隆骨密度有所降低,亦无统计学意义(P>0.05)。试验组新发骨折2例,1例右肱骨骨折,另1例腰椎压缩骨折,对照组新发1例右腓骨头线性骨折;安全性观察:两组不良事件发生率相似。结论重组人甲状旁腺素(1-34)治疗绝经后骨质疏松症有效,对L2骨密度的改善优于益盖宁对,对Ward s区骨密度作用次于益盖宁,对腰椎及股骨其他部位与益盖宁作用相似,安全,不良反应较轻,适用于骨量严重低下和有骨质疏松性骨折的患者。

国产重组人甲状旁腺素1-34联合钙尔奇D治疗原发性骨质疏松症的疗效与安全性观察

目的评价国产重组人甲状旁腺素1-34(recombinant human parathyroid hormone 1-34,rhPTH1-34)治疗原发性骨质疏松症的临床疗效和安全性。方法入选原发性骨质疏松症患者39例,采用自身前后对照试验设计,皮下注射rhPTH1-34每日20μg,同时口服钙尔奇D 600 0.6 g/d,试验时间6个月,观察患者治疗前后骨密度变化、骨折发生情况,以及血尿常规、肝肾功能、电解质、心电图改变等。结果患者L1骨密度(T值,以下同)由-2.58±0.86增加至-1.99±1.06(P<0.01),L2骨密度由-3.21±0.73增加至-2.65±0.92(P<0.01),L3骨密度由-2.89±0.74增加至-2.47±0.89(P<0.01),L4骨密度由-2.58±0.94增加至-2.03±1.08(P<0.01),L平均骨密度由-2.84±0.69增加至-2.31±0.84(P<0.01),股骨颈骨密度由-1.66±1.05增加至-1.54±1.27(P>0.05),大粗隆骨密度由-1.58±0.76增加至-1.54±0.76(P>0.05),Wards区骨密度由-1.98±0.60降低至-1.99±0.83(P>0.05)。试验期间新发骨折2例,其中右肱骨骨折1例,腰椎压缩骨折1例;无其他严重不良事件发生。结论 rhPTH1-34联合钙尔奇D治疗原发性骨质疏松症有效,腰椎骨密度增加显著,不良反应较轻。

纳升电喷雾串联质谱鉴定重组人甲状旁腺素(1-34)

用先进的纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱鉴定重组人PTH(1-34)。通过ESI-MS测定重组人PTH(1-34)分子量及MS/MS对其胰蛋白酶酶解后的肽段的序列和数据库查询进行结构鉴定。重组PTH(1-34)测定分子量为4115.21,与理论值相比测定相差0.06%。MS/MS测定出其中双电荷离子峰m/z728.4肽段序列为VSEIQLMHNLG,以及其他3个单电荷离子峰的序列。数据库检索后确定重组表达的PTH(1-34)一级结构完全正确,纳升电喷雾串联质谱以其灵敏、快速和准确为蛋白质鉴定提供了有效的手段。

人甲状旁腺素活性片段前体物Pro-Pro-hPTH(1-34)的制备及活性研究

目的制备出具有生物活性的人甲状旁腺素活性片段类似物,并对其活性进行考察。方法采用基因工程方法:大肠杆菌BL 21为宿主菌,pET 28a为表达载体,天门冬酰胺酶Ⅱ切除信号肽的C末端片段为融合伙伴,在融合伙伴和目的肽结合处引入Asp Pro酸敏感位点及二肽酶Ⅳ识别的N端Pro Pro位点,之后经诱导表达,酸水解使融合伙伴和目的肽分离。结果成功构建了hPTH(1 34)的融合表达体系,它能高效表达含hPTH(1 34)的融合蛋白,经纯化,得到多肽纯品,经鉴定,该多肽的分子量、氨基酸组成均与设计的分子相符,工程菌中用于编码该多肽的DNA片段其测序结果也与原设计相符,是表达该多肽的正确模板。该多肽在Parsons雏鸡分析及卵巢摘除大鼠模型试验中均显示显著活性。结论用基因工程方法成功地制备出人甲状旁腺素活性片段类似物,该产物具有显著生物活性及潜在的药用价值。

重组人甲状旁腺素1-34肽谱及一级结构的液相色谱/电喷雾离子化质谱法分析

目的:采用液相色谱/电喷雾质谱联用法(LC—ESI—MS/MS)对重组人甲状旁腺素1—34(rh—PTH 1—34)进行肽谱及一级结构分析。方法:用LC—ESI—MS法测定相对分子质量,并在线分析其胰蛋白酶和V8蛋白酶酶解质量肽谱;结合质谱源内碰撞诱导电离技术解析酶解肽段的氨基酸序列。结果:相对分子质量测定值与理论值一致;胰蛋白酶和V8蛋白酶酶解肽段氨基酸序列与理论值基本一致,序列覆盖率分别为97%和88%。结论:LC—ESI—MS/MS联用法为基因重组多肽类药物的一级结构分析和质量控制提供了新途径。

重组人甲状旁腺素1-34分子量测定方法的研究

分别采用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)、Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Tricine-SDS-PAGE)和分子排阻色谱法(SEC)测定重组人甲状旁腺素1-34的相对分子质量,为制定该品种的质量标准提供依据。MALDI-TOF/MS测定基质溶液为α-氰基-4-羟基肉桂酸(a-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid,CCA);Tricine-SDS-PAGE电泳采用Tris-tricine电极缓冲系统;SEC测定色谱柱为TSK-GELG2 000 SWXL(300mm×7.8mm,5μm);流动相为三氟乙酸-乙腈-水(0.05∶20∶80);检测波长为215nm;流速为0.5 mL.min-1。结果:质谱法测定结果准确,实验值与理论值一致,误差±1;Tricine-SDS-PAGE测定结果与理论值基本一致,误差小于10%;但SEC法测定结果与理论值偏差较大。质谱法适用于产品的质量控制。

重组人甲状旁腺素(1-34)治疗原发性骨质疏松症疗效观察

目的观察重组人甲状旁腺素(1-34)[PTH(1-34)]治疗前后骨密度、骨代谢指标变化,以评价该药治疗原发性骨质疏松症疗效。方法 20例原发性骨质疏松症患者皮下注射PTH(1-34)20μg每天1次,每日口服钙尔奇D 600mg,连续治疗6个月。所有患者于治疗前、治疗后第3月、第6月检测腰椎(L2-L4)及股骨颈骨密度、血清骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)、血清I型胶原交基C端肽(CTX)。结果治疗后腰椎(L2-L4)骨密度较治疗前均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。治疗后股骨颈骨密度较治疗前无明显改善(P>0.05)。治疗后第3月、第6月BSAP较治疗前显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),治疗后第6月CTX较治疗前显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 PTH(1-34)能显著提高腰椎(L2-L4)骨密度,对原发性骨质疏松症治疗有效。

国产重组人甲状旁腺素(1-34)对绝经后骨质疏松症的治疗作用研究

目的评价国产重组人甲状旁腺素(1-34)治疗绝经后骨质疏松症的临床疗效和安全性。方法入选绝经后骨质疏松症患者37例,年龄64.2±8.1岁,采用自身前后对照试验设计,每日皮下注射重组人甲状旁腺素(1-34)20μg,同时口服钙尔奇D600 0.6g/d,试验时间6个月,观察患者治疗前后骨密度变化、骨折发生情况,以及血尿常规、肝肾功、电解质、心电图改变等。结果试验期间有1例脱落;经过6个月治疗后,患者L1骨密度增加23.2%(P<0.05),L2骨密度增加18.0%(P<0.05),L3骨密度增加12.5%(P<0.05),L4骨密度增加19.9%(P<0.05),腰椎平均骨密度增加17.8%(P<0.05),股骨颈骨密度增加2.2%(P>0.05),大粗隆骨密度降低6.0%(P>0.05),Wards区骨密度降低1.3%(P>0.05);试验期间新发骨折2例,1例右肱骨骨折,另1例腰椎压缩骨折,无其他严重不良事件发生。结论重组人甲状旁腺素(1-34)治疗绝经后骨质疏松症有效,对腰椎骨密度改善显著,不良反应较轻。