人AFP启动子操控的跨膜型抗CD3单链抗体构建及其在AFP阳性肝癌细胞中特异性表达

目的设计肝癌特异性人甲胎蛋白启动子(hAFPp)操控的跨膜型抗CD3单链抗体(antiCD3scfv),使其仅在AFP阳性(AFP+)肝癌细胞中特异性表达。方法利用分子克隆技术构建pAd-hAFPp-CD3scfv腺病毒载体、pAd-hAFPp-antiCD3scfv穿梭质粒载体,经测序验证其基因序列的正确性。取AFP+人肝癌细胞HepG2、Huh-7及AFP阴性(AFP-)正常人肝细胞HL-7702、人乳腺癌细胞MCF-7,利用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定hAFPp的肝癌细胞转录特异性;通过Western blotting、免疫荧光、流式分析检测antiCD3scfv蛋白在细胞的表达、定位及表达效率。结果构建的pAd-hAFPp-CD3scfv腺病毒载体、pAd-hAFPp-antiCD3scfv穿梭质粒载体,经测序后基因序列正确。hAFPp在AFP+的HepG2、Huh-7细胞中转录活性分别为160.86%±26.24%、80.08%±12.64%,而在AFP-细胞中转录活性均<7%(P均<0.05)。在AdCD3scfv感染的细胞中,仅HepG2、Huh-7细胞中检测到antiCD3scfv蛋白表达(36.7 kD),且表达于细胞膜表面,细胞中GFP+antiCD3scfv+细胞群比例>90%,而HL-7702、MCF-7均无条带出现。结论携带antiCD3scfv蛋白基因的腺病毒感染周围细胞后,hAFPp调控antiCD3scfv在肝癌细胞的细胞膜特异性表达,进而可能实现antiCD3scfv分子直接介导免疫杀伤的抗肿瘤效果。