干扰hsa_circ_0013958/miR-637对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探讨环状RNA(circularRNA,circRNA)hsa_circ_0013958对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Humankeloid fibroblast,HKF)增殖、迁移、侵袭的影响及分子机制。方法:将人瘢痕疙瘩成纤维细胞分为si-NC组、si-hsa_circ_0013958组、miR-NC组、miR-637组、si-hsa_circ_0013958+anti-miR-NC组和si-hsa_circ_0013958+anti-miR-637组。实时荧光定量PCR(Real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试剂盒检测hsa_circ_0013958、miR-637表达;四甲基偶氮唑盐(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测细胞存活率;平板克隆实验检测细胞集落形成数;Transwell检测细胞迁移和侵袭能力;双荧光素酶报告实验检测hsa_circ_0013958和miR-637的靶向关系。结果:瘢痕疙瘩组织中hsa_circ_0013958表达水平较正常皮肤组织升高,miR-637表达水平降低(P<0.05)。干扰hsa_circ_0013958表达或过表达miR-637后,HKF细胞存活率、集落形成数以及迁移、侵袭细胞数均降低(P<0.05)。hsa_circ_0013958和miR-637有靶向调控关系;抑制miR-637表达逆转了干扰hsa_circ_0013958对HKF增殖、迁移侵袭的影响。结论:干扰hsa_circ_0013958通过调控miR-637抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭。

LncRNA COL1A2-AS1调控人瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的研究

目的研究长链非编码RNA(LncRNA)Ⅰ型胶原α2自然反义转录物1(COL1A2-AS1)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡、迁移的影响。方法在COL1A2-AS1的功能研究中将人成纤维细胞分为3组:空白组、空载组、COL1A2-AS1-过表达组。qRT-PCR检测miR-181a-5p、TGF-β1、Smad7、Col-Ⅲ、COL1A2-AS1的表达。CCK-8法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell法检测细胞迁移,Western blot检测TGF-β1、Smad7、Col-Ⅲ蛋白的表达水平。双荧光素酶报告实验验证COL1A2-AS1与所预测的靶标miR-181a-5p的结合关系。结果与空载组比较,COL1A2-AS1-过表达组的人成纤维细胞增殖OD值、迁移细胞数以及Col-Ⅲ的表达都明显下调(P<0.05),而TGF-β1和Smad7的表达水平都明显升高(P<0.05)。与空载组比较,COL1A2-AS1-过表达组细胞的凋亡率增加(P<0.05)。另外,与空载组比较,COL1A2-AS1-过表达组明显抑制miR-181a-5p的表达(P<0.05),且经过双荧光素酶报告实验验证COL1A2-AS1和miR-181a-5p可直接结合。结论COL1A2-AS1直接靶向抑制miR-181a-5p的表达,并抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和迁移,促进细胞的凋亡。

miR-16-5p通过靶向SPARC促进人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的研究

目的 探究miR-16-5p对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)凋亡的作用及机制。方法 利用实时PCR技术检测人正常皮肤成纤维细胞(NFB)和KFB中miR-16-5p水平;利用细胞转染分别将miR-16-5p的对照序列(对照组)、miR-16-5p的模拟物序列(模拟物组)、miR-16-5p的互补序列(抑制物组)转染入KFB后,利用荧光显像技术和实时PCR技术检测转染效果;利用流式细胞仪和形态学手段评估各组KFB凋亡情况;利用Western blotting技术检测各组KFB凋亡相关蛋白含量;利用荧光素酶报告基因技术和Western blotting技术验证miR-16-5p的下游靶基因。结果 与NFB相比,KFB中miR-16-5p低表达;与对照组相比,模拟物组KFB内miR-16-5p含量增加(P<0.05),抑制物组KFB内miR-16-5p含量降低(P<0.01);与对照组相比,模拟物组KFB凋亡增加,抑制物组KFB凋亡减少(均P<0.05);与对照组相比,模拟物组KFB中Caspase-3和Bax表达增加,而Bcl-2表达减少;抑制物组KFB中Caspase-3和Bax表达减少,而Bcl-2表达增加(均P<0.05);与对照组相比,模拟物组抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白基因(SPARC)3′UTR质粒的荧光素酶活性(P<0.05);与对照组相比,模拟物组KFB中SPARC蛋白低表达,而抑制物组KFB中SPARC蛋白高表达(P<0.05)。结论 miR-16-5p在KFB中低表达,miR-16-5p可通过靶向SPARC促进KFB的凋亡。

三七总甙对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用

目的:观察三七总甙对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成的作用,以寻找治疗人瘢痕疙瘩的有效药物。方法:体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞,分别应用噻唑蓝(MTT)比色法和H3-脯氨酸掺入法检测三七总甙作用后细胞增殖及胶原合成的变化。结果:与空白对照组相比,三七总甙含量在0.5,1.0和1.5g/L时均能够显著抑制成纤维细胞增殖及胶原合成(P<0.01),但在1.5g/L时对细胞具有毒性作用。结论:三七总甙具有体外抗纤维化作用,可能成为治疗瘢痕疙瘩的有效药物。

马齿苋提取物调控miR-199a-5p对人瘢痕疙瘩成纤维细胞生长和胶原合成的影响

目的探讨马齿苋提取物调控miR-199a-5p对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(HKF)生长和胶原合成的影响。方法将HKF细胞分为对照组、马齿苋提取物(50、100、200μg/mL)组、miR-NC组、miR-199a-5p组、anti-miR-NC+200μg/mL马齿苋提取物组、anti-miR-199a-5p+200μg/mL马齿苋提取物组。CCK-8法检测HKF细胞活力,流式细胞术检测细胞周期分布,RT-qPCR法检测细胞miR-199a-5p表达,Western blot法检测细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达。结果与对照组比较,马齿苋提取物组细胞活力、S期细胞比例、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达降低(P<0.05),miR-199a-5p表达、G_(0)/G_(1)期细胞比例升高(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-199a-5p组细胞活力、S期细胞比例、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达降低(P<0.05),G_(0)/G_(1)期细胞比例升高(P<0.05)。与anti-miR-NC+200μg/mL马齿苋提取物组比较,anti-miR-199a-5p+200μg/mL马齿苋提取物组细胞活力、S期细胞比例、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达升高(P<0.05),G_(0)/G_(1)期细胞比例降低(P<0.05)。结论马齿苋提取物可能通过上调miR-199a-5p表达抑制HKF细胞生长和胶原合成。

RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β_1刺激结缔组织生长因子表达的影响

目的体外构建结缔组织生长因子(CTGF)序列特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体,研究其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF表达基因和蛋白的影响。方法体外构建CTGF序列特异性siRNA质粒表达载体,Dosper脂质体转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞后,用10ng/ml剂量的转化生长因子(TGF-β1)刺激细胞,采用RQ-PCR和Western blot观察CTGF mRNA和蛋白水平的变化。结果经TGF-β1刺激后,重组质粒组CTGF mRNA仅为正常表达的56.6%(P<0.05),CTGF蛋白仅为正常表达的基线水平(P<0.05)。结论siRNA质粒表达载体可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF基因表达和蛋白分泌,即使在TGF-β1刺激条件下,其分泌功能仍明显受抑。

下调lncRNA-H19表达促进人瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡和自噬

目的探讨下调长链非编码RNA-H19(lncRNA-H19)表达对人瘢痕疙瘩成纤维细胞系凋亡和自噬的影响,并初步探讨其作用机制。方法取人类瘢痕成纤维细胞系(KFs)及健康人皮肤成纤维细胞系(HDFs),将KF细胞感染lncRNA-H19F低表达腺病毒(si-lncRNA-H19)及不含si-lncRNA-H19的空病毒载体(si-eGFP)。分为HDFs组、KF组、si-lncRNA-H19+KFs组、si-eGFP+KFs组;KFs细胞共感染si-lncRNA与mTOR过表达腺病毒(Ad-mTOR)及空载体(Ad-eGFP-m),分为KFs组、si-lncRNA-H19+Ad-mTOR组、si-eGFP+Ad-mTOR组、si-lncRNA-H19+Ad-eGFP组、si-eGFP+Ad-eGFP组。RT-qPCR检测lncRNA-H19表达;流式细胞测量术检测细胞凋亡率;透射电镜及吖啶橙(Ao)荧光染色观察自噬形成情况;免疫组化法检测自噬通路-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)阳性表达;Western blot检测凋亡及自噬相关蛋白表达。结果与HDFs组比较,KFs组细胞lncRNA-H19表达及mTOR活性升高,自噬泡数目、凋亡与自噬相关蛋白表达降低(P<0.05);下调KFs细胞中的lncRNA-H19后,KFs细胞mTOR活性降低,凋亡及自噬活性升高(P<0.05)。下调lncRNA-H19的同时,上调mTOR,KFs细胞的自噬及凋亡活性较单独下调lncRNA-H19时升高(P<0.05)。结论下调lncRNA-H19表达,可能通过抑制mTOR途径活化,促进KFs细胞自噬及凋亡。

miR-582-5p靶向DNMT1对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨微小RNA-582-5p(miR-582-5p)对DNA甲基转移酶1(DNMT1)的靶向作用及对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响。方法实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)检测瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)和正常皮肤成纤维细胞(NFB)miR-582-5p、DNMT1 mRNA、DNMT1蛋白表达。starBase网站与双荧光素酶报告实验分析miR-582-5p与DNMT1的靶向关系。瘢痕疙瘩成纤维细胞中转染miR-582-5p或si-DNMT1,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western Blot检测DNMT1、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。miR-582-5p和pcDNA-DNMT1共转染,观察DNMT1过表达对miR-582-5p过表达诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响。结果与NFB组比较,KFB中miR-582-5p表达量明显减少(P<0.05),DNMT1 mRNA和DNMT1蛋白表达量显著增加(P<0.05)。miR-582-5p靶向调控DNMT1的表达。miR-582-5p过表达或抑制DNMT1表达明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表达(P<0.05),显著促进细胞凋亡、p21蛋白、Bax蛋白表达(P<0.05)。DNMT1过表达逆转miR-582-5p过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表达的抑制作用,以及对细胞凋亡、p21蛋白、Bax蛋白表达的促进作用。结论miR-582-5p通过靶向调控DNMT1的表达抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,并诱导其凋亡。

miR-200c对TGF-β_1刺激后人瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响

目的:观察转染mi R-200c mi mi cs对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(HKFs)胶原蛋白分泌的影响。方法:将mi R-200c mi mi cs用ol i gof ect ami脂质体转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞后,3H-脯氨酸掺入法测加入50μg/L剂量的转化生长因子(TGF-β1)刺激前后胶原蛋白水平的变化。结果:转染mi R-200c mi mi cs后,胶原蛋白分泌水平降为正常皮肤成纤维细胞表达水平;经TGF-β1刺激后,其蛋白水平仍无明显变化。结论:mi R-200c可明显抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原蛋白分泌,推测其机制是通过抑制TGF-β1生物学作用。

MicroRNA-200c通过TGF-β/Smad通路抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成

目的:探讨mi croRNA-200c(miR-200c)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成的影响,并阐明其涉及的TGF-β/Smad通路机制。方法:将mi R-200c mi mics用oligofectami脂质体转染经TGF-β1诱导的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法测细胞增殖变化;3H-脯氨酸掺入法测胶原蛋白水平的变化。相关蛋白表达变化和TGF-β1分泌表达变化分别用Western blot和ELISA法检测。结果:mi R-200c明显抑制经TGF-β1诱导的人瘢痕疙瘩纤维细胞的增殖和胶原合成;mi R-200c能明显减低磷酸化Smad2和Smad3的蛋白表达水平及抑制博莱霉素诱导的TGF-β1分泌。结论:miR-200c能明显抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成,其机制可能与抑制TGF-β/Smad通路相关。

miR-200c抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成的研究

目的：探讨miR-200c对人瘢痕疙瘩成纤维细胞human keloid fibroblasts，HKFs）增殖和胶原合成的影响及阐明其机制。方法：将miR-200c mimics用oligofectami脂质体转染经转化生长因子（TGF）-β1诱导的HKFs，CCK-8法测细胞增殖变化；3H-脯氨酸掺入法测胶原蛋白水平的变化。Western blot检测细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）及磷酸化ERK1／2蛋白表达变化。结果：在有或无TGF-β1刺激下，miR一200c均能明显抑制HKFs的增殖能力及胶原合成，并且能明显减低磷酸化ERK1／2蛋白表达水平，但对非磷酸化ERK表达无影响。结论：miR-200c能抑制HKFs增殖和胶原合成．并起拮抗TGF-B1的作用。其机制可能是通过降低ERK通路活性介导实现的。

三羟基异黄酮对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及侵袭作用的影响

目的观察5,7,4’-三羟基异黄酮(Genistein)对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞生长及侵袭作用的影响,探讨其抗纤维化作用的机制。方法以25、50、100μmol/L浓度Genistein处理体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,MTT法检测细胞增殖活性,3H-脯氨酸掺入法检测细胞胶原合成,Transwell小室趋化运动模型检测细胞侵袭能力。结果Genistein作用后,瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖及胶原合成作用降低,细胞的侵袭能力显著下降。随着药物浓度增加,对细胞的这种抑制作用也增强。结论Genistein具有体外抗瘢痕疙瘩成纤维细胞纤维化与侵袭的作用,可成为治疗病理性瘢痕及纤维化疾病的有效药物。

人瘢痕疙瘩成纤维细胞原代培养及生物学行为研究

目的:建立可靠的人瘢痕疙瘩成纤维细胞培养方法,为瘢痕疙瘩体外研究提供平台。方法:采用组织块贴壁法进行瘢痕疙瘩成纤维细胞的原代培养,使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,37℃,5%CO2,饱和湿度下培养;描述其生长曲线、分裂指数、形态及波形蛋白表达。结果:瘢痕疙瘩成纤维细胞培养成功率43%(6/14),48～65天可传第一代,以后每5～10天可传一代,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性。结论:培养出的瘢痕疙瘩成纤维细胞可用作体外实验研究。

人参皂苷Rg3对培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活性的影响

目的:研究人参皂苷Rg3(GS-Rg3)对体外培养人瘢痕疙瘩的直接抑制作用及可能机制。方法:通过活细胞计数法与MTT比色法分别检测不同浓度GS-Rg3(25、50、100和200 mg.L-1)在不同作用时间(24、48和72 h)对成纤维细胞增殖活性的影响。结果:与对照组相比GS-Rg3对瘢痕疙瘩成纤维细胞有抑制作用,随着时间延长及浓度增加,抑制作用有增加趋势。最大抑制浓度为100 mg.L-1。结论:GS-Rg3对体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞有抑制作用,且随着时间延长及浓度增加,其抑制作用增强。

wt-P53蛋白对人瘢痕疙瘩成纤维细胞端粒酶活性的影响(英文)

目的 探讨wt-P53蛋白对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloidfibroblasts，KFBS）端粒酶活性的影响；明确在人KFBs中wt-P53蛋白与端粒酶活性之间的相互关系。方法 将来源于人瘢痕疙瘩组织的KFBs随机分成两组，转染组采用腺病毒介导法将野生型Wt-p53基因转染至人KFBs；非转染组KFBs未进行野生型wt-p53基因转染。转染48h后，采用间接免疫荧光法和Western blotting法检测KFBs wt-P53蛋白的表达；并于转染后1～7d，采用TRAP—ELISA法检测KFBs端粒酶活性。结果两组均有wt-P53蛋白表达，转染组Wt-P53蛋白表达明显高于非转染组；转染后1～7d，转染组端粒酶活性均明显低于非转染组（P〈O．05）。结论 wt-P53蛋白能够抑制人KFBs端粒酶活性。

SiRNA-Smad3沉默人瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad3对纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原表达的影响

目的:探讨SiRNA-Smad3沉默人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid fibroblast,KFB)内Smad3基因后,对KFB细胞内纤维接蛋白及Ⅰ型胶原表达水平的影响。方法:分别用针对人Smad3 mRNA基因的特异性干扰片段和无关干扰片段转染体外原培养的人KFB,经RT-PCR、Western blot、免疫组化、免疫荧光方法检测纤维连接蛋白(fibronectin)及Ⅰ型胶原(CollagenⅠ,Col等KFB细胞外基质的合成和分泌情况。结果:75nmol/L Smad3-siRNA特异性干扰片段转染KFB48h后KFB细胞内ColⅠ及合成和分泌较非特异性对照组及空白对照组明显降低。结论:Smad3-siRNA可特异性抑制KFB细胞中Smad3基因表达,并效抑制体外培养的人原代KFB合成和分泌ColⅠ及纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)。

miR-214-5p通过调控SFRP2影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡

目的研究人瘢痕疙瘩形成过程中微小RNA-214-5p(miR-214-5p)与分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)2对成纤维细胞增殖及凋亡的影响并分析可能作用机制。方法分离培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)与正常皮肤成纤维细胞(NFB),miR-214-5p mimic、miR-NC、si-SFRP2、si-NC分别转染KFB细胞,应用qRT-PCR与Western印迹分别检测miR-214-5p、SFRP2 mRNA及蛋白表达变化。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法与流式细胞术分别检测细胞增殖与凋亡。采用双荧光素酶报告实验检测miR-214-5p是否可调控SFRP2基因。结果 KFB细胞中miR-214-5p表达水平显著低于NFB细胞(P<0.05),而SFRP2 mRNA与蛋白表达水平显著高于NFB组(P<0.05)。miR-214-5p组KFB细胞增殖活力明显低于miR-NC组(P<0.05),与miR-NC组相比,miR-214-5p组CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而p21、p27蛋白表达水平显著升高(P<0.05),转染miR-214-5p mimic后KFB细胞凋亡率显著高于miR-NC组(P<0.05),Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05),而Bax、酶切caspase-3表达水平均显著升高(P<0.05),SFRP2与miR-214-5p存在结合位点,共转染miR-214-5p mimic与WT-SFRP2野生型质粒的KFB细胞相对荧光素酶活性显著低于共转染miR-NC与WT-SFRP2野生型质粒的KFB细胞(P<0.05),表明miR-214-5p可与SFRP2基因的3′UTR结合而调控其活性。miR-214-5p组SFRP2蛋白(0.17±0.03)显著低于miR-NC组(0.58±0.05,P<0.05);anti-miR-214-5p组SFRP2蛋白(0.92±0.08)显著高于anti-miR-NC组(0.59±0.06,P<0.05)。相较于si-NC组,转染si-SFRP2可显著抑制细胞增殖及显著促进细胞凋亡,共转染miR-214-5p mimic与pcDNA-SFRP2后细胞增殖活力显著高于miR-214-5p+pcDNA组(P<0.05),与miR-214-5p+pcDNA组比较,miR-214-5p+pcDNA-SFRP2组细胞凋亡能力显著降低(P<0.05)。结论 miR-214-5p负向调控SFRP2表达并通过影响细胞增殖及凋亡蛋白表达进而抑制KFB增殖并促进细胞凋亡。

秋水仙碱对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及细胞周期的影响

目的：研究秋水仙碱对体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid Fibroblast,KFB）的毒性作用及细胞周期的影响。方法：体外培养人KFB,不同浓度秋水仙碱（1、2、4、8、16、32μg/ml）处理细胞。采用MTT比色法检测KFB的毒性作用;采用流式细胞仪检测秋水仙碱对KFB的细胞周期（G2期）的影响。结果：MTT法结果显示1μg/ml组（12.56±0.79）%,2μg/ml组（27.35±0.50）%,4μg/ml组（34.36±0.25）%,8μg/ml组（39.38±0.57）%,16μg/ml组（40.38±0.23）%,32μg/ml组（44.65±0.60）%（F=2440.178,P=0.000）;流式细胞仪检测结果显示空白对照组（0.67±0.46）%,1μg/ml组（4.26±1.51）%,2μg/ml组（24.51±4.69）%,4μg/ml组（45.12±2.75）%,8μg/ml组（55.81±5.04）%,16μg/ml组（69.90±3.61）%,32μg/ml组（85.53±2.06）%,F=491.609,P=0.000。秋水仙碱能抑制细胞的生长,对细胞分裂前期（G2期）产生影响,并呈时间依赖性和药物浓度依赖性。结论：在24 h时间点,秋水仙碱在1-32μg/ml浓度范围内可调控细胞的生长及细胞周期,可以抑制瘢痕疙瘩的形成。

人瘢痕疙瘩成纤维细胞IKKβ特异性siRNA的筛选和载体构建

背景:近年来的研究表明核转录因子κB通过调控多种基因的表达,参与细胞生长、发育、凋亡等多种生理功能,并在细胞恶性转化、纤维化等方面起重要作用。核转录因子κB抑制蛋白激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)β是核转录因子κB激活通路中的关键激酶,被抑制后可以阻断核转录因子κB的活化过程,通过siRNA干扰沉默IKKβ基因,下调核转录因子κB。目的:体外合成并筛选人瘢痕疙瘩成纤维细胞特异性IKKβ-siRNA,并构建其表达载体。设计、时间及地点:细胞观察实验,于2008-04/2008-10在解放军广州军区总医院中心实验室完成。材料:细胞来源为珠江医院整形外科25～40岁患者切除的瘢痕疙瘩标本,患者知情同意。方法:化学合成3条IKKβ-siRNA,分别转染体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,采用反转录-聚合酶链反应技术检测所合成的SiRNA对IKKβ表达的抑制,筛选出特异性IKKβ-siRNA,并采用PU6质粒构建载体。主要观察指标:①RT-Q-PCR检测结果。②载体基因连接产物酶切鉴定。③重组质粒测序鉴定。结果:经实时定量反转录-聚合酶链反应检测,合成的3条IKKβ-siRNA链中,IKKβ-siRNA-2有明显抑制IKKβmRNA表达的作用,IKKβ-siRNA-1、IKKβ-siRNA-3干扰效果不明显。并通过酶切鉴定和测序结果证明成功构建IKKβ-siRNA载体。结论:应用反转录-聚合酶链反应可筛选出针对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的特异性IKKβ-siRNA;可构建具有干扰效果的IKKβ-siRNA表达载体。

微小RNA-4463对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭的影响

目的研究微小RNA-4463(miR-4463)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移、侵袭的影响以及机制。方法收集延安大学附属医院2017年12月至2019年6月整形手术病人40例,每例切除瘢痕疙瘩组织1个以及邻近正常皮肤组织1个,利用定量聚合酶链反应(qPCR)检测人正常成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-4463的表达量;将miR-4463模拟物对照质粒和miR-4463模拟物分别在Lipofectamine 2000介导下转染入瘢痕疙瘩成纤维细胞,分为miR-NC组和miR-4463组;常规培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞作为对照;qPCR检测转染后miR-4463的表达量;qPCR检测上调miR-4463对瘢痕疙瘩纤维化相关基因Col1 A1、Col 3 A1表达的影响;细胞计数试剂盒(CCK-8)检测上调miR-4463对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响,Transwell实验检测细胞的迁移、侵袭;采用TargetScan软件预测miR-4463与B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关的致病基因BAG4的靶向关系,双荧光素酶报告基因进一步进行验证。结果miR-4463在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量较人正常成纤维细胞显著降低[(0.218±0.036)比(1.000±0.071),P<0.05];与对照组相比,转染miR-4463模拟物明显增加瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-4463的表达量[(1.000±0.073)比(3.313±0.242),P<0.05];上调miR-4463显著抑制瘢痕疙瘩纤维化相关基因Col 1 A1[(1.000±0.065)比(0.334±0.010)]、Col 3 A1[(1.000±0.070)比(0.301±0.008)]的表达量(P<0.05);上调miR-4463抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖[(0.836±0.081)比(0.656±0.072),P<0.05],降低其迁移[(153.269±12.471)个比(82.363±7.254)个]、侵袭细胞数[(73.623±6.451)个比(36.459±3.235)个](P<0.05);BAG4是miR-4463下游靶基因。结论miR-4463可能通过调控BAG4抑制细胞外基质中纤维化相关胶原基因的表达,抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移、侵袭。