野生型和突变型人白介素13哺乳细胞表达质粒的构建

目的:构建野生型及突变型人IL-13(hIL-13)哺乳细胞表达质粒。方法:采用融合PCR扩增人生长激素(hGH)-hIL13融合蛋白编码序列。PCR产物和pcDNA3.1表达载体经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切处理后,将PCR产物定向插入pcDNA3.1真核表达载体中,构建质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g。将其转化到DH5α感受态细胞内进行扩增,阳性克隆鉴定,质粒抽提,进行测序验证。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g经测序验证,hGH-hIL13融合蛋白编码序列与实验设计一致,且已与pcDNA3.1(+)真核表达载体正确重组。结论:成功构建了哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g,为后续野生型及突变型hIL-13哺乳细胞的重组表达奠定了基础。

野生型和突变型人白介素13的大肠杆菌表达及活性分析

利用大肠杆菌表达野生型和突变型重组人白介素13(IL-13),以获得具有生物学活性的重组蛋白。采用PCR方法从质粒pET22b-hIL-13上扩增人成熟IL-13的编码序列。用定点突变引物扩增IL-13突变体(IL-13m)编码基因。将IL-13和IL-13m编码基因分别克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建质粒pET28a(+)-IL-13和pET28a(+)-IL-13m,然后将质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,构建重组体,IPTG诱导重组蛋白表达。重组蛋白采用镍柱(Ni-NTA)纯化,纯化后复性,并分析其生物学活性。结果成功得到IL-13和IL-13m重组蛋白,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约14.6 kD的位置出现明显蛋白条带,经Western blot证实为重组hIL-13蛋白;重组蛋白主要以包涵体形式存在。纯化复性后,重组蛋白具有生物学活性。最后成功获得了具有生物学活性的野生型和突变型重组人IL-13,为后续研究奠定了基础。

人白介素-13对牛主动脉内皮细胞表达黏附分子的影响

目的研究人白介素-13(hIL-13)对牛主动脉内皮细胞(BAECs)表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和E-选择素的影响,为hIL-13应用于诱导异种移植免疫耐受、减轻异种移植排斥反应提供实验依据. 方法用不同浓度的hIL-13(2、5、10、20及40 ng/ml)孵育 BAECs 2 h后,再与肿瘤坏死因子-α(TNF-α, 4 ng/ml)共孵育6 h或18 h; 应用细胞-酶联免疫吸附分析方法(Cell-ELISA)检测BAECs表面的E-选择素和ICAM-1的表达; 用MTT方法测定hIL-13对BAECs活性的影响. 结果用hIL-13在5～20 ng/ml浓度内预处理BAECs后,能明显抑制TNF-α诱导的E-选择素与ICAM-1的表达,并呈现一定的剂量依赖性(P＜0.01).经不同浓度hIL-13处理的BAECs活性与未经hIL-13处理者相比差异无统计学意义. 结论 hIL-13能明显抑制BAECs表达E-选择素与ICAM-1,诱导异种移植的免疫耐受,且hIL-13对BAECs无损伤作用.