人白介素24重组蛋白的表达及其抗肿瘤机理的研究

将人白细胞介素24(hIL24)的cDNA序列克隆至原核高效表达载体pET21a(+)上,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中获高效表达,经纯化、复性后的rhIL24蛋白具有抑制HeLa细胞生长,诱导HeLa细胞凋亡,刺激外周血单核细胞分泌IL6、TNFα、IFNr,抑制血管形成的功能。初探了rhIL24蛋白能通过下调抗凋亡因子bcl2表达,激活线粒体凋亡途径引起肿瘤细胞凋亡的机理。

人白介素24腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建人白介素24(hIL_24)的腺病毒载体,获得hIL_24重组腺病毒子,为hIL_24进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3.0_hIL_24重组质料为模板,PCR扩增hIL_24,酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack_CMVR质粒上,PmeI线性化重组质粒pAdTrack_CMV_hIL_24,与腺病毒质粒pAdEasy_1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdEasy_1_pAdTrack_CMV_hIL_24,经Pacl线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获腺病毒重组病毒子,RT_PCR和Western_blotting鉴定。结果测序结果显示hIL_24序列正确,RT_PCR和Western_blotting检测到了hIL_24的表达。结论成功构建人白介素24的重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack_CMV_hIL_24,获得了人白介素24重组病毒子Ad_hIL_24。

人白介素24融合载体的构建、突变纠正和表达优化

以武汉大学病毒学国家重点实验室保存的白介素24(IL-24)为模板,构建原核表达载体pET28a-IL-24,转化大肠杆菌DH5α,挑取单克隆,测序结果显示:在IL-24第18位A→G,21位C→T,412位G→A,18位和21位的突变没有使该位上的氨基酸发生改变,而412位的突变导致了该位点上的氨基酸发生改变——由丙氨酸A变为苏氨酸T。通过设计突变引物,二次PCR将其纠正,转化大肠杆菌BL21。通过改变诱导剂IPTG的浓度、诱导时间和诱导温度摸索最佳诱导条件,SDS-PAGE、Western blot检测显示有融合蛋白6hisIL-24表达。结果表明:通过二次PCR成功构建了IL-24原核表达载体,表达产物主要以包涵体的形式存在,最佳诱导温度为28℃,最佳诱导剂浓度为1mmol/L,最佳诱导时间是8h。

人hIL-24Δ103重组腺病毒感染诱导A549细胞凋亡

白细胞介素24(interleukin24,IL-24)是近年来新发现的1个IL-10家族细胞因子,具有明显的抗肿瘤活性.为了研究开发高活性、低分子量的IL-24,并探讨其用于肿瘤靶向治疗的可能性,本研究在前期基础上,进一步构建并制备了缺失N端103个氨基酸残基的IL-24(hIL-24Δ103)重组腺病毒,并观察了其对A549细胞生长增殖和凋亡的影响.首先,采用PCR技术扩增IL-24第104位至第206位氨基酸区域的编码序列,制备hIL-24Δ103重组腺病毒.用Ad-hIL-24Δ103重组腺病毒感染肺癌A549细胞.MTT分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染显著抑制了A549细胞的生长.Hoechst 33258染色和流式细胞仪分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染导致细胞凋亡.Western印迹分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染导致了PKR和eIF-2α蛋白的表达上调与磷酸化激活,提示PKR和eIF-2α参与了hIL-24Δ103导致的细胞生长抑制和细胞凋亡过程的调节.

带有IL-24的腺病毒扩增及其在小鼠树突状细胞中的表达

目的:在293细胞中扩增带有IL-24的腺病毒,感染小鼠树突状细胞,观察IL-24在树突状细胞中的表达。方法:将构建的重组腺病毒表达载体IL-24转染到293细胞中包装、扩增,感染分离培养的小鼠树突状细胞,RT-PCR、Western blot、荧光显微镜检测IL-24的表达。结果:获得了大量的带有IL-24的腺病毒,成功的感染小鼠树突状细胞,RT-PCR和Western blot检测结果显示,IL-24在树突状细胞中高表达。结论:带有IL-24的腺病毒可以高效的感染小鼠树突状细胞。

Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞生长抑制的体外实验

旨在研究携带人IL-24基因的腺病毒表达载体(Ad-IL-24)对SGC-7901人胃癌细胞的生长抑制作用并分析其分子机制。以不同MOI(感染复数)的Ad空载体腺病毒感染SGC-7901人胃癌细胞,筛选出最佳感染剂量;Ad-IL-24以最佳感染剂量感染SGC-7901胃癌细胞,RT-PCR法和Western blotting法检测腺病毒介导的IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中的转录;MTT法检测Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测其诱导SGC-7901人胃癌细胞凋亡和细胞周期改变的效应,Hoechst33258染色荧光显微镜检测其诱导胃癌细胞凋亡的核形态改变;RT-PCR半定量法进一步检测SGC-7901胃癌细胞中凋亡相关基因的转录。结果显示,100MOI为感染SGC-7901胃癌细胞的腺病毒最佳感染剂量;Ad-IL-24能成功介导IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中转录性表达;Ad-IL-24感染SGC-7901胃癌细胞后,能明显抑制胃癌细胞生长和诱导凋亡;Ad-IL-24能显著上调SGC-7901胃癌细胞中bax、caspase-3和p53的表达和下调bcl-2的表达。因此,腺病毒介导的IL-24表达具有明显抑制SGC-7901人胃癌细胞生长和诱导凋亡的抗肿瘤效应,其机制可能与上调bax/bcl-2、caspase-3和p53密切相关。