人白介素6受体结合功能域的构效关系研究

以分子对接(docking)方法研究人白介素6受体胞外区配基结合功能域“WSXWS”区氨基酸残基定点突变对受体与配基人白介素6结合时的相互作用能量、分子间相互作用的影响,从分子力学、分子动态学分析了人白介素6受体胞外区功能域关键氨基酸残基在受体与配基结合中的构象变化以及与人白介素6间的相互作用.

人白介素6受体拮抗剂的构建及其在大肠杆菌中的表达

白介素6的过高表达往往与一些疾病的发生和发展有关,如一些自身免疫性疾病、增生性疾病和某些恶性肿瘤。这种情况下就有必要拮抗或抑制IL-6的作用以达到治疗的目的。一般来说,细胞因子的可溶性受体作为细胞因子结合蛋白(CBPs)可以拮抗相应因子的作用,但IL-6的可溶性受体(sIL-6R)却不同,它与IL-6形成的复合物仍然能与信号转导子gp130结合,介导IL-6的效应,起到IL-6激动剂的作用,因而有必要构建具拮抗效应sIL-6R的突变体分子,以用于IL-6相关疾病的治疗研究。

人白介素6cDNA的克隆及在CHO细胞中的表达

人白细胞介素6(IL-6)是一种关键的多功能的细胞因子,它对造血、免疫和急性期应答起重要作用。重组IL-6在辐射损伤,血小板减少、肝损伤、肿瘤及艾滋病的研究与治疗中具有重要意义和潜在的应用前景。本研究通过引物设计、转译优化及DNA体外重组等技术构建了pSV-IL-6重组质粒,在大肠杆菌中大量扩增、纯化后,利用磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr^+),经选择培养基培养2周后,挑出CHO-dhfr^+细胞克隆。

利用α-溶血素系统分泌表达重组人白介素-6

目的构建基于大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌机制的原核胞外分泌表达载体系统,将重组人白介素6(rhIL-6)分泌至胞外培养基中。方法利用分子克隆手段,从引起人泌尿道感染的大肠杆菌UPECJ96菌株染色体上获得了α-溶血素(HlyA)系统的分泌功能基因,与外源基因片段hIL-6一起克隆至pQE30骨架载体,构建了胞外分泌表达质粒pISQ,转化E.coliTop10,诱导表达后通过Western blot检测培养上清中hIL-6的表达。结果获得了与设计完全一致的pISU载体,Western blot结果显示,可以在pISQ/E.coli Top10培养液上清中检测到与His-hIL6-HlyAs融合蛋白相对分子质量大小一致的特异条带。结论大肠杆菌HlyA分泌系统操纵子能够在染色体和质粒间传递,rhIL-6能够通过该系统被特异地分泌至胞外培养基中,以可溶形式存在,为后续生物学研究奠定了基础。

人白介素6与其受体结合特定结构域的预测

借助人白介素６的核磁共振构象，以人生长因子受体为模板同源模建的人白 介素６受体空间构象，通过表观静电势分析，结合空间构象的互补性对人白介素６与其 受体进行分子对接，在分子力学优化、分子动力学动态模拟的基础上获得稳定的复合物 结构，从理论上预测人白介素６与其受体相互作用的结构域，进一步确定影响人白介素 ６与其受体相互作用的特定位点，为确定靶蛋白人白介素６的活性部位、利用计算机寻 找和辅助设计新的拮抗剂提供理论依据．

基因工程人白介素-6中试工艺研究

本研究对基因工程人白介素－6成熟肽在大肠杆菌中的表达、纯化及检定做了一系列的研究，建立了一套罐培养诱导表达，乙酸裂解包涵体，复性及纯化的中试工艺，并制备3批半成品，经检定各项指标已接近国家基因工程产品质控标准。

人白介素-6表达质粒的构建及在酿酒酵母中的表达

将带有哺乳动物细胞信号肽的人白细胞介素-6(hIL-6)基因片段构建到大肠杆菌-酵母细胞穿梭型质粒pYES2中,获得表达质粒pYES2-hIL-6.另外,将表达质粒pYES2-hIL-6转化到酿酒酵母细胞DBY747中,并将获得的转化子在含2％乳糖的YP培养基中培养到OD_(600)=1.0左右,后用2％的半乳糖进行了诱导表达.结果发现,在培养上清中发现人白介素-6的分泌.

hIL-6·hIL-6Rα·gp130三元复合物的结构预测

通过Delphi方法分析人白介素 6 (humaninterleukin 6 ,hIL 6 ) /人白介素 6受体α亚基 (humaninterleukin 6receptorαsubunit,hIL 6Rα)复合物、gp130 (βsubunit)的空间构象的表观静电分布 ,利用分子对接方法研究 gp130与hIL 6 /hIL 6Rα复合物作用形成三元复合物的空间构象 ,经过分子力学优化、分子动力学常温动态模拟借助分子间相互作用 (范德华力、氢键、盐键等 )、反应自由能理论探讨hIL 6·hIL 6Rα·gp130复合物稳定构象结合部位的结构域 .分析结果表明 ,gp130蛋白表面富集较强的负电势 ,复合物hIL 6 /hIL 6R一侧表面富集较强的正电势 ,gp130借助蛋白表面的静电作用结合hIL 6 /hIL 6R复合物 ,介导hIL 6信号 ;hIL 6中的helix C、loop BC、loop CD参与同 gp130中的loopEF、linker、loopA′B′、loopB′C′、loopD′E′作用 ,hIL 6R中的loopA′B′、β strandE′参与同gp130中的loopA′B′、β strandE′作用 .

吴茱萸碱对结直肠癌小鼠IL-6R/STAT3通路的影响

目的探讨吴茱萸碱对结直肠癌小鼠的抑瘤作用及对白介素-6受体(interleukin-6 receptor,IL-6R)/信号转导转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路的影响。方法将59只BALA/C小鼠随机留取9只作为对照组,其余皮下接种CT-26结直肠癌细胞株建立结直肠癌小鼠模型,将建模成功的40只小鼠随机分为模型组、顺铂组、吴茱萸碱组和顺铂+吴茱萸碱组,每组10只。顺铂组用15 mg·kg^(-1)·d^(-1)顺铂灌胃,顺铂+吴茱萸碱组用15 mg·kg^(-1)·d^(-1)顺铂+15 mg·kg^(-1)·d^(-1)吴茱萸碱灌胃,对照组、模型组用等量生理盐水灌胃。各组均每日灌胃1次,连续19周。末次灌胃24 h后,处死小鼠,称肿瘤质量并计算肿瘤体积、肿瘤抑制率;用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠肿瘤组织的白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平;用HE染色观察小鼠肿瘤组织的病理学变化;用免疫组织化学法检测肿瘤组织的微血管密度(microvesse density,MVD)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平;用Western blot检测肿瘤组织中IL-6R/STAT3通路相关蛋白的表达水平。结果从模型组到吴茱萸碱组、顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组,小鼠肿瘤的质量依次减轻、肿瘤体积依次减小,IL-6、IL-1β、TNF-α水平依次降低(P<0.05)。模型组小鼠肿瘤组织中可见大片灶性坏死,细胞核增大、深染,大小不一,排列紊乱,有异形表现,呈典型恶性肿瘤细胞形态特征,肿瘤细胞密集;吴茱萸碱组、顺铂组和顺铂+吴茱萸碱组的肿瘤细胞核固缩、变小,肿瘤细胞形态破坏,密度依次降低,肿瘤组织内坏死区依次增大,MVD依次减小(P<0.05),VEGF阳性表达依次减弱(P<0.05)。从模型组到吴茱萸碱组、顺铂组、顺铂+吴茱萸碱组,小鼠肿瘤组织中IL-6R、p-STAT3、G 1/S-特异性周期蛋白-D1(G 1/S specific cyclin D1,Cyclin D1)、生存素(survivin)的蛋白水平依次下降(P<0.05)。结论吴茱萸碱可能通过抑制IL-6R/STAT3通路,发挥抗血管生成效应,从而抑制肿瘤的生长。

通心络对2型糖尿病合并冠心病患者血清抵抗素的影响

目的研究通心络对2型糖尿病合并冠心病(DM-CHD)患者抵抗素的影响。方法将120例DM-CHD患者随机分为常规治疗组(对照组)和常规治疗加通心络组(通心络组),每组60例,另设60例健康人作为正常组。DM-CHD患者在治疗2个月后,收集空腹后的血清,测定人抵抗素(RSTN)、人超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、人白介素-6(IL-6)、内皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。结果对照组和通心络组RSTN、hs-CRP、IL-6、HOMA-IR、ET-1显著高于正常组(P<0.05),NO低于正常组(P<0.05)。与同组治疗前比较,通心络组治疗后RSTN、hs-CRP、IL-6、HOMA-IR、ET-1显著下降(P<0.04),NO上升(P<0.05)。结论通心络能够抑制DM-CHD患者抵抗素升高,进而抑制炎性因子hs-CRP、IL-6表达,从而改善DM-CHD患者胰岛素抵抗和血管内皮功能。

人IL-6重组蛋白及IL-6荧光免疫层析检测试剂卡的研制

研制一种人IL-6荧光免疫层析检测试剂卡,用于IL-6分子的临床快速检测,并且研制一种重组表达人IL-6蛋白作为IL-6检测试剂卡的标准品。首先获得人IL-6基因序列,经密码子优化后连接到表达载体pET30a,然后转化到大肠杆菌BL21感受态细胞诱导表达。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside, IPTG)诱导后,得到可溶性表达的IL-6蛋白。经镍柱亲和层析纯化和超滤,得到重组人IL-6蛋白。基于荧光免疫层析技术及双抗体夹心法原理,应用时间分辨荧光微球制备IL-6荧光免疫层析检测试剂卡。经性能评估,试剂卡的空白限为5.2 pg/mL,变异系数在7.34%~11.11%之间,重复性较好;回收率在96.3%~107.2%之间;试剂卡37℃放置6周稳定性较好,与常见竞争物无交叉反应,参考值范围0~9.0 pg/mL;与电化学发光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA)比较临床样本检测结果相关性较好,相关系数r值为0.965。综上,研制的IL-6重组蛋白具有较高的纯度及浓度,可作为试剂盒检测的标准品;制备的IL-6定量检测试剂卡性能可满足临床应用的需求,且具有简便、快捷等优点。

卡巴胆碱对重症患者的治疗价值

目的:探讨卡巴胆碱在重症患者治疗中的临床价值。方法:选取2008年1月-2010年12月唐山市3家三级医院ICU重症患者300例。随机分为卡巴胆碱组(182例)和正常治疗组(118例)。正常治疗组包括液体复苏、氧疗、禁食、止痛、胃肠减压、器官功能维护等;卡巴胆碱组在常规治疗的基础上给予卡巴胆碱肌肉注射,每次0.2mg·kg-1,每日2次。于治疗前(0h),治疗后24,48,72,96h或患者死亡前观察2组患者胃肠功能评分和血清CRP及IL-6的变化。结果:卡巴胆碱可以减低胃肠功能评分、改善肠道功能;抑制炎症因子释放,降低炎症反应。结论:卡巴胆碱在重症患者治疗中具有一定的临床价值。