牛蒡子苷元对白血病K562/A02细胞耐药性的逆转作用及机制

目的:研究牛蒡子苷元对白血病耐药细胞株K562/A02阿霉素耐药性的影响及其作用机制。方法:体外培养人白血病细胞株K562及阿霉素耐药细胞株K562/A02,使用2.5-50μmol/L阿霉素处理,CCK-8检测细胞生长情况并计算药物半数抑制浓度(IC_(50))。采用不同浓度的牛蒡子苷元(1、2、4、8、16 mmol/L)处理K562/A02细胞,检测牛蒡子苷元对K562/A02细胞的影响,筛选适用浓度用于后续实验。在2 mmol/L牛蒡子苷元处理的K562/A02细胞中加入5μmol/L阿霉素,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测P-gp、MRP、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2以及TLR4/NF-κB信号通路蛋白的表达。在牛蒡子苷元和阿霉素共处理的K562/A02细胞中转染TLR4过表达质粒,检测细胞的药物敏感性和凋亡水平。结果:阿霉素对K562/A02细胞的IC_(50)为36.57μmol/L,高于K562细胞(1.30μmol/L)。当牛蒡子苷元浓度≤2 mmol/L时,K562/A02的细胞生长不会受到明显抑制。经2 mmol/L的牛蒡子苷元处理后,阿霉素对K562/A02细胞的IC_(50)明显降低。与对照组相比,牛蒡子苷元组K562/A02细胞凋亡率明显上升,cleaved caspase-3、Bax蛋白的表达明显上调,P-gp、MRP、Bcl-2、TLR4、My D88和p-NF-κB蛋白的表达明显下调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在转染TLR4过表达质粒后,牛蒡子苷元处理的K562/A02细胞对阿霉素的敏感性明显降低(P<0.05),细胞凋亡下降,并显著提升了P-gp、MRP、Bcl-2和TLR4/NF-κB信号通路蛋白的表达(P<0.05),同时降低了cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达(P<0.05)。结论:牛蒡子苷元可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路从而逆转人白血病耐药细胞株K562/A02对阿霉素的耐药性。

解毒化淤药对白血病K562/A02、HL60/Adr细胞P-gp、Bcl-2、P53基因表达影响的研究

目的探讨解毒化淤中药复方含药血清对白血病K562/A02、HL60/Adr细胞P-gp、Bcl-2、P53基因表达的影响。方法应用中药血清药理学方法制备解毒化淤药的兔血清,以MTT法检测经含药血清处理后K562/A02、HL60/Adr细胞对化疗药物的敏感性;免疫组化方法检测P-gp、Bcl-2、P53耐药基因表达情况。结果 MTT结果显示不同浓度解毒化淤含药血清对K562/A02、HL60/Adr细胞均有耐药逆转作用,其逆转倍数随剂量增加而增大;免疫组化结果显示解毒化淤药含药血清能够降低K562/A02、HL60/Adr细胞耐药基因P-gp和抗凋亡基因Bcl-2的表达,但对P53基因无影响。结论解毒化淤方含药血清逆转白血病K562/A02、HL60/Adr细胞耐药的机制是降低P-gp和bcl-2的表达而逆转耐药的,对P53基因表达无影响。

白血病K562/A02细胞MDR1、NF-κB的表达及解毒化瘀中药的调控作用研究

在白血病细胞的耐药机制中,核周因子NF-κB与肿瘤细胞的发生、增殖、分化、凋亡及耐药有密切关系,是多药耐药（multidrug resistance,MDR1）信号转导途径中的主要信号分子,在白血病细胞表达与耐药有关的因素中可能起关键的调控作用。本研究采用血清药理学方法和分子生物学技术研究解毒化瘀药含药血清对人白血病耐药细胞系K562/A02细胞NF-κB信号的影响,探讨解毒化瘀药对K562/A02耐药逆转机制。

急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/A02细胞株耐药的影响

本研究探讨急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)对K562/A02细胞耐药性的影响及其机制。从白血病患儿骨髓中分离、培养并鉴定MSC;建立K562/A02细胞株与MSC共培养的体系,应用AnnexinV-FITC检测一定浓度的阿霉素(ADM)对不同培养条件下K562/A02细胞凋亡的影响;RT-PCR检测K562/A02细胞中的凋亡基因家族中bcl-2和bax基因;荧光定量PCR检测多药耐药基因mdr1浓度。结果表明,单独培养组白血病细胞早期凋亡率为(8.38±0.29)%,而黏附培养组为(1.97±0.11)%,差异具有统计学意义(p<0.05)。相对于单独悬浮培养的K562/A02细胞,黏附共培养的K562/A02细胞bcl-2基因表达明显增强,bcl-2/bax比值显著增高;K562/A02单独悬浮培养组、黏附共培养组细胞中mdr1的水平比较无统计学差异(p>0.05)。结论:白血病患儿MSC能够使白血病细胞逃避药物的促凋亡作用,K562/A02对阿霉素产生耐药性可能与黏附共培养后bcl-2基因表达增强有关,而与其本身含有的mdr1基因无关。

去铁胺对白血病细胞K562/A02的影响及机制研究

本研究旨在探讨铁螯合剂去铁胺对人白血病耐阿霉素细胞K562/A02的影响及其作用机制。采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测不同浓度去铁胺作用48小时对K562/A02细胞增殖的抑制效应;流式细胞术检测去铁胺25、50、100和200μmol/L作用K562/A02细胞48小时后细胞的凋亡率;半定量RT-PCR检测各组细胞凋亡基因BAX、BCL-2以及多药耐药基因1(MDR1)mRNA表达变化;Western blot检测各组细胞P-糖蛋白(P-gp)表达变化。结果显示,随着去铁胺药物浓度的增加,细胞活力逐渐下降,凋亡率明显增加,呈剂量依赖性;随着去铁胺浓度增加,BAX表达水平逐渐升高,但MDR1 mRNA与P-gp的表达受到显著抑制。结论:去铁胺可以通过螯合细胞内铁,影响细胞DNA的合成;同时去铁胺可抑制阿霉素诱导的MDR1、P-gp表达,增加白血病细胞对化疗药物的敏感性,进而诱导凋亡。

多药耐药K562/A02和敏感K562细胞来源的树突状细胞介导抗白血病效应对比研究

本研究探讨多药耐药(MDR)白血病K562/A02细胞和敏感K562细胞诱导树突状细胞(DC)分化及介导的抗白血病效应。采用慢性粒细胞白血病(CML)P170糖蛋白(Pgp)高表达的MDRK562/A02细胞、敏感K562细胞在含细胞因子GMCSF(1000U/ml)、IL4(500U/ml)和TNFα(100ng/ml)的RPMI1640完全培养液中诱导分化成DC,以光镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型,异基因混合淋巴细胞反应(alloMLR)检测T细胞增殖活性,MTT法测定细胞毒作用。结果表明:培养14天的K562/A02细胞和K562细胞均出现典型的DC形态特征,表达DC的相关分化抗原及共刺激分子CD1a、CD83、HLADR、CD80、CD86。alloMLR检测中,K562/A02DC较K562DC具有更强的刺激异基因T细胞增殖能力(P<0.05)。两种DC激活的CTL分别对K562/A02和K562细胞较HL60细胞具有显著的杀伤活性(P<0.01);更重要的是,K562/A02DC较K562DC激活的CTL对Pgp高表达的MDRK562/A02细胞、HL60/VCR细胞具有更强的细胞毒作用,杀伤活性分别为(40.7±1.3)%、(28.4±0.9)%(P<0.01)和(24.9±1.1)%、(8.2±0.7)%(P<0.01)。结论:Pgp高表达的MDR白血病细胞K562/A02和敏感K562细胞都可在GMCSF、IL4和TNFα作用下诱导分化为成熟DC,均可活化CTL产生特异的抗白血病效应;尤其K562/A02细胞来源的DC可介导针对Pgp高表达的多药耐药白血病的特异细胞毒作用。

亚砷酸对白血病K562/A02细胞的作用及机制

目的研究亚砷酸对白血病多药耐药细胞株K562/A02细胞的作用及对多药耐药基因1(mdr1)、P糖蛋白(P-gp)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨亚砷酸逆转白血病多药耐药(MDR)的作用机制。方法将K562/A02细胞与不同浓度的亚砷酸(0、0.5、2.0、5.0μmol/L)共同孵育,分别在24、48、72h时,用Wrights染色法观察K562/A02细胞形态,流式细胞术(FCM)检测凋亡细胞,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR法检测mdr1mRNA的表达,免疫组织化学法观察P-gp表达,并用ELISA法检测VEGF的浓度。结果随着亚砷酸作用浓度和时间的增加,K562/A02细胞的数目减少,并出现凋亡形态学改变,FCM显示随着作用浓度和时间的增加,细胞凋亡率逐渐上升;从作用48h组开始,mdr1mRNA及P-gp的表达出现显著降低(P<0.05),mdr1mRNA条带颜色较空白对照组明显变浅,mdrl/GAPDH灰度比值下降,此时,P-gp的灰度值上升,且随亚砷酸作用浓度和时间的增加,mdr1mRNA条带颜色进一步变浅,表达水平进一步下降;ELISA法检测表明从0.5μmol/L作用24h组开始,VEGF浓度即下降至405.02pg/mL(P<0.05),相同作用时间下以5.0μmol/L组较其它浓度组下调VEGF的作用最为显著。结论亚砷酸呈药物浓度-时间依赖性抑制K562/A02细胞增殖,诱导其凋亡,下调VEGF表达,有效抑制了mdrlmRNA的产生和P-gp的合成。

解毒化瘀药对白血病K562/A02耐药细胞mdr1耐药基因、核因子κB信号影响的研究

目的:探讨解毒化瘀药含药血清对白血病K562/A02细胞mdr1耐药基因、核因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)信号基因表达的影响。方法:采用半定量逆转录聚合酶链反应法检测解毒化瘀药含药血清处理后K562/A02细胞mdr1基因的表达;Western blot法检测NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα的表达。结果:解毒化瘀药含药血清能够降低K562/A02耐药细胞NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα表达,降低mdr1耐药基因的表达。结论:解毒化瘀药对K562/A02细胞的耐药逆转作用可能是通过阻断NF-κB信号通路,影响mdr1耐药基因的表达起作用的。

白血病K562/A02细胞Survivin基因表达及解毒化瘀药干预作用的研究

目的:探讨解毒化瘀药含药血清对白血病K562/A02细胞Survivin基因(生成素)表达的影响。方法:应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测解毒化瘀药含药血清处理后K562/A02细胞Survivin基因的表达,并与干扰素作对照。结果:解毒化瘀药含药血清能够降低K562/A02细胞Survivin基因的表达。结论:解毒化瘀药含药血清通过降低K562/A02细胞Survivin基因的表达,逆转白血病细胞耐药。

白血病K562/A02细胞Mdr1基因的表达及解毒化淤药干预作用研究

目的探讨解毒化淤药含药血清对白血病K562/A02细胞Mdr1耐药基因表达的影响。方法应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测解毒化淤药含药血清处理后K562/A02细胞Mdr1基因的表达,并与干扰素作对照。结果解毒化淤药含药血清能够降低K562/A02细胞Mdr1基因的表达。结论解毒化淤药含药血清通过降低K562/A02细胞Mdr1耐药基因的表达,逆转白血病细胞耐药。

益气养阴解毒方含药血清对白血病K562/A02细胞凋亡干预作用的初步研究

目的:探讨益气养阴解毒方含药血清对白血病K562/A02细胞凋亡作用的影响。方法:采用血清药理学方法制备益气养阴解毒方含药血清,以不同浓度的含药血清处理体外培养的K562/A02白血病细胞,采用MTT比色法观察益气养阴解毒方含药血清对K562/A02细胞增殖的影响。应用流式细胞术检测益气养阴解毒含药血清诱导K562/A02细胞凋亡的影响。结果:不同浓度益气养阴解毒方含药血清对K562/A02细胞增殖具有抑制作用,并呈剂量依赖关系。高、中、低剂量的益气养阴解毒方含药血清可诱导K562/A02细胞的凋亡,其凋亡作用以中、高剂量中药血清组最强。结论:益气养阴解毒方含药血清具有抑制K562/A02白血病细胞增殖作用,可诱导K562/A02白血病细胞明显凋亡,其作用机理可能与其直接细胞毒作用有关。

贝母素甲对多药耐药人白血病细胞活力和凋亡的影响及机制

目的观察贝母素甲对多药耐药白血病人细胞K562/A02活力与细胞凋亡的影响,探讨活性氧(ROS)在此过程中的作用。方法将K562/A02细胞成3组,药物组分别加入终浓度为100、200、400μmol/L的贝母素甲;NAC预处理组采用5 mmlo/L ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)预处理后,再加入终浓度为400μmol/L的贝母素甲;对照组加等体积的药物溶解介质RPMI1640培养基。采用MTT法检测各组细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,紫外分光光度法检测细胞内ROS、GSH水平。结果与对照组比较,药物组细胞活力均降低(P<0.05或<0.01)、细胞内ROS水平增高(P均<0.01)、GSH水平下降(P均<0.01)、细胞凋亡率上升(P均<0.05),NAC预处理组的细胞活力、细胞凋亡率和ROS水平无明显变化(P均>0.05)。结论贝母素甲可抑制多药耐药人白血病细胞K562/A02的细胞活力、诱导其凋亡;其机制是通过诱导细胞ROS爆发,引起GSH水平下降,从而逆转多药耐药的发生。

miR-155通过调节Ets-1逆转白血病细胞阿霉素耐药的研究

目的通过检测人白血病细胞株K562及阿霉素耐药细胞株K562/A02中miR-155和Ets-1表达,探讨miR-155、Ets-1表达与白血病化疗耐药的关系。方法利用Lipofectamine 2000将含有miR-155模拟物和miR-155抑制物的寡核苷酸探针、Ets-1过表达质粒以及Ets-1干扰质粒转染K562及K562/A02细胞,实时荧光定量PCR法检测miR-155、Ets-1及多药耐药基因(MDR1)的表达,Western blotting检测Ets-1和MDR1蛋白表达水平;转染后的K562及K562/A02细胞经阿霉素处理24 h,MTT法检测细胞存活率。结果与K562细胞相比,K562/A02细胞中miR-155、Ets-1和MDR1表达水平显著升高(P<0.05)。抑制miR-155表达能显著增强阿霉素对K562/A02细胞的抑制作用,并抑制Ets-1和MDR1表达,而MDR1表达抑制效应可被Ets-1过表达所逆转。结论 miR-155通过调节Ets-1表达参与白血病耐药形成,miR-155有可能成为逆转白血病耐药的作用靶点。

vegf shRNA对耐药白血病细胞化疗敏感性的增强作用

本研究采用RNA干扰技术探讨血管内皮生长因子(VEGF)对耐药白血病细胞K562/A02药物敏感性的影响及其机制。针对人vegf基因合成3个特异性shRNA干扰片段,采用脂质体介导的方法将其导入K562/A02细胞,用RT-PCR检测vegf及mrp1的mRNA表达水平,用Western blot检测VEGF、MRP1、AKT及P-AKT的蛋白表达情况,用MTT法检测阿霉素对各组细胞的半数抑制浓度(IC50),用流式细胞术检测细胞凋亡、胞内罗丹明123(Rho123)积聚情况。结果表明:转染vegf shRNA后,K562/A02细胞vegf的mRNA表达下调,其中vegf shRNA2组和vegf shRNA3组与HK组比较有显著差异(p<0.05),以vegf shRNA3组最显著,VEGF蛋白表达也出现下调,与mRNA的表达基本一致;MTT检测结果显示阳性转染组对阿霉素的敏感性增加,其中vegf shRNA2组和vegfshRNA3组的半数抑制浓度(IC50)与HK组比较具有显著的统计学差异(p<0.05);阳性转染组胞内Rho123积聚增多,与HK组比较均有统计学差异(p<0.05);阳性转染组细胞凋亡增加,其中vegf shRNA2组和vegf shRNA3组与HK组比较有统计学意义(p<0.05);阳性转染组MRP1mRNA蛋白及表达均下调,以vegf shRNA3组下调最显著;阳性转染组P-AKT的表达水平低于对照组,以vegf shRNA3组最明显,而总的AKT无明显变化。结论:vegf shR-NA可以抑制vegf的基因的转录及翻译,从而增加耐药白血病细胞对阿霉素的敏感性,其机制可能是vegf shRNA通过抑制PI3K/AKT信号转导通路的活化而促进细胞凋亡及下调MRP1的表达。

四氢异喹啉类化合物HZ08通过降低白血病细胞的葡萄糖神经酰胺合成酶和MDR1表达水平逆转耐药作用

通过对比K562/A02细胞株和耐药白血病临床样本的实验结果,探讨四氢异喹啉类化合物HZ08对多药耐药的逆转作用和逆转机制。将阿霉素与10μmol/L HZ08合用,MTT法测得阿霉素对临床耐药的白血病细胞的IC50为0.60μmol/L,对K562/A02细胞的IC50为0.83μmol/L,逆转倍数分别为27.87和20.49。使用免疫印迹法检测细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)表达水平,荧光实时定量聚合酶链反应检测MDR1的mRNA表达水平。结果显示:各浓度的HZ08(15,20,25μmol/L)与阿霉素合用均能降低GCS的表达,与单用阿霉素组相比,阿霉素与HZ08合用可显著降低MDR1的mRNA表达(P<0.01)至空白组水平。结果表明,HZ08与阿霉素合用给药,对K562/A02细胞株和耐药的临床耐药白血病细胞均有较强的逆转作用,其机制可能与降低细胞内GCS蛋白的表达和MDR1 mRNA的表达有关。

甲基莲心碱、红霉素对K562/A02细胞内谷胱甘肽含量的影响

目的 :探讨甲基莲心碱 (Nef)、红霉素 (EM)对K5 6 2 /A0 2细胞内谷胱甘肽 (GSH)含量的影响 ,及其对白血病细胞代谢解毒系统介导的多药耐药 (MDR)的逆转作用。方法 :采用生物化学DTNB法测定细胞内GSH含量。结果 :K5 6 2 /A0 2细胞内GSH含量为 (137.34± 33.10 )mg/mgprot,高于K5 6 2细胞内GSH含量 (73.38± 10 .0 2 )mg/mgprot(P<0 .0 5 ) ,且为K5 6 2细胞的 1.87倍 ;Nef10mg/L ,EM 10 0mg/L ,Nef10mg/L +EM 10 0mg/L ,维拉帕米 (VRP) 5mg/L处理 2d后K5 6 2 /A0 2细胞内GSH含量分别为 (6 9.0 1± 15 .99)mg/mgprot,(70 .5 7± 11.93)mg/mgprot,(6 5 .74± 13.37)mg/mgprot,(70 .86± 16 .16 )mg/mgprot,均较无药组含量 (137.34± 33.10 )减低 (P <0 .0 5 )。结论 :细胞内GSH含量增高是K5 6 2 /A0 2细胞产生MDR的机制之一 ;Nef,EM能使K5 6 2 /A0 2细胞内GSH含量下降可能是其逆转耐药白血病细胞MDR的机制之一。

干扰α烯醇化酶对耐药细胞株K562/A02耐药性的影响

目的肿瘤耐药的产生是肿瘤治疗失败的主要原因之一,α烯醇化酶(eno1)与肿瘤细胞耐药产生和发展密切相关。探究eno1对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02生长及耐药的影响。方法筛选3株稳定干扰eno1的细胞系K562/A02-sheno1和对照细胞系K562/A02-shcon;采用细胞计数法测定细胞生长速率,MTT法测定细胞增殖能力,细胞内罗丹明123含量测定细胞外排药物能力,real-time PCR反应测定基因mRNA表达水平,Western blot实验测定基因蛋白表达水平。结果与敏感性细胞株K562相比,eno1在耐药细胞株K562/A02中为高表达状态,其在mRNA水平和蛋白水平表达分别增高(2.85±0.56)倍和(1.43±0.05)倍;而K562/A02细胞生长速率与K562细胞相比差异无显著性。K562/A02-sheno1细胞系与对照组K562/A02-shcon相比生长速率降低,对抗肿瘤药物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增强,且K562/A02-sheno1细胞系中罗丹明123含量也明显增高。K562/A02-sheno1细胞系中耐药相关基因MDR1表达水平降低。结论稳定干扰eno1表达能抑制K562/A02细胞生长,有效逆转K562/A02细胞耐药性,提高其对药物的敏感性,其机制与MDR1基因表达相关。

活化Chk1引起的G_2/M期阻滞在调节K562/A02细胞耐药中的机制探讨

本研究探讨活化的Chk1对白血病细胞周期及凋亡的影响,探究Chk1调控肿瘤细胞耐药的机制。以慢性粒细胞白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02(耐阿霉素)为研究对象,与阿霉素共孵育后,用流式细胞术检测细胞周期分布,RT-PCR检测Chk1mRNA表达水平,Westernblot检测转染前后Chk1磷酸化水平;靶向Chk1shRNA抑制细胞内Chk1的表达后,用流式细胞术检测阿霉素作用后细胞的凋亡情况。结果表明阿霉素致K562/A02细胞阻滞在G2/M期的细胞百分率为(54.12±0.57)%,显著高于K562细胞(36.99±1.28)%;Chk1mRNA表达水平在K562与K562/A02细胞间无显著差异;Chk1磷酸化水平在K562/A02细胞为0.79±0·56,在K562细胞为0.27±1·47,其差异有统计学意义。转染Chk1shRNA后,两株细胞的Chk1磷酸化水平显著下降。转染组K562、K562/A02细胞凋亡率分别是空载体转染组的1.30倍和3.84倍。结论Chk1的活化水平调控着K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。

解毒化瘀方含药血清对K562/A02细胞凋亡抑制蛋白及核周因子κB表达的影响

目的探讨解毒化瘀方含药血清对白血病K562/A02细胞凋亡抑制蛋白survivin基因和核周因子κB(NF-κB)信号基因表达的影响。方法将K562/A02细胞分为6个组,分别加入等体积牛血清,兔血清,高、中、低剂量中药血清和干扰素,并设K562敏感细胞株为对照。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测解毒化瘀方含药血清处理后K562/A02细胞survivin的表达;Western blot法检测NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα的表达。结果 survivin耐药基因在K562/A02细胞中高表达,加用解毒化瘀含药血清处理后,高、中剂量中药血清组和干扰素对照组能够survivin的表达明显降低。NF-κB在K562/A02耐药细胞亦呈高表达,加用解毒化瘀含药血清处理后,P65、P50和IκBα的表达均有不同程度下降,以高、中剂量组最明显,且高剂量组P65、P50表达下降优于干扰素对照组(P<0.05),IκBα下降与干扰素对照组相当(P>0.05)。结论解毒化瘀方能够降低K562/A02细胞NF-κB信号基因的表达,影响NF-κB-survivin途径逆转耐药。