树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株的建立及鉴定

目的建立树鼩视网膜来源的微血管内皮细胞的体外分离培养技术以及永生化细胞株,为体外利用树鼩视网膜微血管内皮细胞开展相关研究提供新的实验材料。方法利用Ⅱ型胶原酶、分散酶和DNaseⅠ酶消化法分离培养出原代视网膜微血管内皮细胞,利用差速消化法纯化内皮细胞,然后利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞,再挑取单克隆后进行传代培养。对传至50代以上的细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定以及核型鉴定。结果采用混合酶消化法能够分离获得微血管内皮细胞,纯化后的细胞呈不规则多角形和梭形。经慢病毒转染后的细胞传代培养后细胞形态一致,到第50代时细胞形态结构仍较好。细胞免疫荧光结果显示标志性蛋白VWF、CD34、Claudin1、ZO-1和永生化SV40T表达阳性。生长曲线结果显示:细胞生长旺盛,第2~4天时处于对数生长期,第4天进入平台期。细胞核型结果显示:染色体数与树鼩染色体相同,即所获取的细胞为永生化的树鼩视网膜微血管内皮细胞。结论成功建立的树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株具有较好的形态结构与功能,为视网膜病变及眼科相关疾病的研究提供了新的实验材料。

MCI-186对高糖环境中受损人真皮微血管内皮细胞的保护作用

目的 观察高糖环境对人真皮微血管内皮细胞(HDMEC)功能的影响,探讨清除自由基对高糖所致HDMEC损伤的保护作用。方法 建立高糖环境下HDMEC培养的体外模型,并加入自由基清除剂MCI-186予以干扰,同时检测细胞的增殖、形态、黏附等生物学行为。结果 高糖环境可影响内皮细胞的增殖,改变其特异性形态,增加H2O2诱导的细胞毒性。MCI-186可缓解高糖所致的内皮细胞增殖受抑,降低内皮细胞表面黏附性,下调高糖诱导的细胞凋亡。结论 控制血糖的同时清除有害自由基,可能对糖尿病合并难愈创面的治疗起到积极作用。

人真皮微血管内皮细胞的体外分离和原代培养

目的：建立体外分离及培养人真皮微血管内皮细胞的方法，为进一步开展创面愈合及相关领域的细胞和分子生物学研究提供物质基础和实验模型。方法：健康成人中厚皮组织经中性蛋白酶消化后去除表皮；然后，采取薄片真皮组织胰蛋白酶低湿慢速灌注法消化微血管内皮细胞；将获取的微血管内皮细胞于不同条件的培养基内连续培养５～１５ ｄ，观察其基本生物学生长特征，并采用免疫细胞化学方法行Ⅷ因子相关抗原染色鉴定。结果：①采用中性蛋白酶及胰蛋白酶分步消化法，所分离获得的细胞体外具有很强的增殖能力；该细胞呈现Ⅷ因子相关抗原阳性，说明为真皮微血管内皮细胞；②细胞单层培养时显示活跃的形成类管腔状结构的生物学特征；③真皮微血管内皮细胞在不同培养基内生长状态不同，含８％ 胎牛血清、２ ％ 人分娩前母体血清及适量ｃＡＭＰ等添加物的ＩＭＤＭ 为其较理想的培养基。结论：经体外分离及培养获得了生长性良好的人真皮微血管内皮细胞。

桃红四物汤对UVA辐射后人真皮微血管内皮细胞表达氧自由基及ICAM-1的影响

目的:通过测定紫外线照射人真皮微血管内皮细胞(HDMEC)建立的光损伤模型中清除自由基的酶SOD、CAT和细胞间黏附分子ICAM-1的含量,探讨中药汤剂桃红四物汤对UVA诱导的人真皮微血管内皮细胞光损伤后自由基形成和细胞间黏附分子的影响,进而探讨桃红四物汤对光损伤模型中人真皮微血管内皮细胞的保护作用,并从细胞分子层次阐明桃红四物汤拮抗光损伤的作用机理,为皮肤光损伤应用桃红四物汤来治疗提供了进一步深入研究的依据。方法:建造HDMEC细胞的培养与传代模型,通过ELISA方法检测抗氧化损伤标志物超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、细胞间黏附分子(ICAM-1)来研究桃红四物汤在离体人类细胞层次上对于治疗光老化的作用。结果:UVA照射可使HDMEC细胞分泌CAT、SOD降低并提高ICAM-1表达水平。且桃红四物汤高、中、低剂量含药血清均能够促进HDMEC细胞分泌CAT、SOD升高并抑制ICAM-1表达水平,高剂量组效果最好。

光老化人真皮微血管内皮细胞模型的建立及桃红四物汤的保护作用

目的：建立人真皮微血管内皮细胞光老化模型,并观察桃红四物汤对其影响。方法：体外培养人真皮微血管内皮细胞,将其接种于96孔板中,分为UVA模型组、空白血清组、低剂量含药血清组、中剂量含药血清组、高剂量含药血清组5组,各组细胞接种后,培养24 h,以5 J/cm2的照射剂量对细胞进行照射,于照射后24 h在倒置光学显微镜下观察细胞损伤的形态学变化,采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,评价桃红四物汤含药血清抗HDMEC细胞光老化作用。结果：与空白对照组比较,空白血清组及不同浓度桃红四物汤含药血清组细胞活性显著降低,有统计学差异（P〈0.01）;与空白血清组比较,不同浓度的桃红四物汤含药血清组细胞增值活性均显著升高（P〈0.01）;与低剂量含药血清组比较,中高剂量含药血清组细胞活性显著升高。结论：桃红四物汤对光老化人真皮微血管内皮细胞具有一定的保护作用。

人真皮微血管内皮细胞的原代培养及低氧/复氧模型的建立

目的:培养人真皮微血管内皮细胞,建立人真皮微血管内皮细胞低氧/复氧模型。方法:采用酶消化及联合磁珠分选法,得到人真皮微血管内皮细胞(HDMECs),体外培养传至P5代,采用Ⅷ因子免疫荧光及CD309、CD34流式细胞学进行鉴定。用缺氧Buffer加低氧舱的方法低氧处理P5代HDMECS。实验分为四组,Con组不做任何处理、H8组低氧8小时组,H8R12组低氧8小时复氧12小时组、H8R24组低氧8小时复氧24小时组。TUNEL(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)染色法检测细胞凋亡,蛋白质印迹法(Western Blot)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白的表达。结果:联合法分离的细胞,经过2次CD31磁珠分选后,可见细胞短梭形,呈铺路石样。细胞传至P5,Ⅷ因子免疫荧光染色阳性率为(95±2.61)%。流式细胞仪检测CD309阳性率为(95.4±1.34)%;CD34阳性率为(42.5±3.23)%。TUNEL染色、Western Blot结果显示:H8组的细胞凋亡率和活化的Caspase-3表达高于Con组(P<0.05),H8R12组、H8R24组细胞凋亡率和活化的Caspase-3表达高于H8组(P<0.05)。结论:本研究采用磁珠分选的办法成功培养了HDMECs,并且建立了HDMECs低氧/复氧模型,为临床研究游离皮瓣缺血再灌注损伤机制提供实验基础。

舒洛地特对低氧状态下人真皮微血管内皮细胞凋亡的影响

目的:探讨舒洛地特(sulodexide,SDX)对低氧状态下人真皮微血管内皮细胞(human dermal microvascular endothelial cells,HDMECs)凋亡的影响及其分子机制。方法:对HDMECs进行分组培养:常氧对照组在常氧状态下培养;低氧对照组于1%O_2、5%CO_2、37℃条件孵箱培养24 h;处理组用不同浓度(0.25、0.5和1 LSU/m L)舒洛地特作用于HDMECs低氧培养24 h。CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;caspase-3活性检测试剂盒测定细胞内caspase-3活性;Western blot和real-time PCR检测促凋亡因子P53、Bax和caspase-3及凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白及m RNA表达。结果:低氧状态下舒洛地特可提高HDMECs生长活力,降低其凋亡率,抑制促凋亡因子P53、Bax和caspase-3的表达以及caspase-3的活性,提高抑凋亡因子Bcl-2的表达。结论:舒洛地特可以抑制低氧状态下人真皮微血管内皮细胞的凋亡,其分子机制与抑制线粒体凋亡通路有关。

低温暴露对真皮微血管内皮细胞功能的影响

目的:探讨低温暴露对真皮微血管内皮细胞损伤效应及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:利用非连续密度梯度Percoll分离液原代分离培养大鼠真皮微血管内皮细胞(DMVECs),免疫荧光检测CD31抗原的表达并结合形态学鉴定细胞。将DMVECs暴露于不同低温(28℃、12℃及0℃)条件下24 h,建立低温细胞暴露模型,通过倒置显微镜观察细胞形态,测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性评价细胞膜完整性,应用半定量反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果:培养的DMVECs呈典型的鹅卵石样排列,CD31抗原表达呈阳性。大鼠DMVECs于不同低温暴露24 h后,与37℃组比较,28℃组及12℃细胞形态趋于"成纤维样",而0℃组细胞出现明显的皱缩;28℃,12℃及0℃组细胞培养液中LDH活性(U/L)分别为54.17±3.02,64.66±3.03,82.13±10.91,与37℃组(12.23±3.03)比较统计学差异显著(P<0.01);28℃组及12℃组VEGFmRNA表达上调(P<0.05),但0℃组与37℃无统计学差异。结论:随温度降低,大鼠DMVECs损伤程度加重,其中VEGF可能参与低温致皮下血管通透性的增加。

桃红四物汤对UVA辐射致人真皮微血管内皮细胞损伤保护作用研究

目的：该文通过模拟光老化皮肤状态,即制造UVA日光照射后损伤的人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）模型,研究桃红四物汤对其白细胞介素-1α（IL-1α）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、内皮型一氧化氮合酶（e NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）表达的影响,并以此来阐述桃红四物汤对UVA辐射后受损HDMEC的保护作用。方法：选用大鼠制作不同浓度桃红四物汤血清模型,将HDMEC细胞株分组,制作UVA辐射细胞损伤模型,并给予不同浓度含药血清以及生理盐水作为干预措施,培养并收集上清液备用,采用ELISA法检测IL-1α、IL-6、TNF-α、SOD、CAT指标,用Western Blot法检测e NOS指标。结果：桃红四物汤可显著抑制UVA辐射后受损的HDMEC中IL-1α、IL-6、TNF-α的表达并提高e NOS、SOD、CAT的表达。结论：（1）UVA辐射可以导致HDMEC损伤;（2）桃红四物汤含药血清通过抑制炎症反应,增加血管活性物质和清除自由基来保护UVA辐射下损伤的HDMEC。

桃红四物汤对UV辐射致人真皮微血管内皮损伤后TGF-β、Smad2/3表达影响的实验研究

目的:旨在研究桃红四物汤对模拟UVA照射后损伤HDMEC的保护作用。方法:以5J/cm2UVA辐射HDMEC建立紫外线光损伤的人真皮微血管内皮细胞模型,分别给予不同浓度的桃红四物汤,检测不同浓度药物作用下的细胞凋亡及分泌TGF-β、Smad2/3蛋白的情况。结果:与空白对照组比较,模型对照组细胞凋亡数显著上升,细胞培养上清液中TGF-β含量降低,细胞TGF-β、Smad2/3表达降低;与模型对照组比较,桃红四物汤含药血清干预的各组细胞凋亡数均显著下调,培养上清液中TGF-β含量增加,细胞TGF-β、Smad2/3表达升高,以高剂量组和阳性对照组上升最为明显。结论:桃红四物汤含药血清能有效保护UVA诱导的真皮微血管内皮细胞损伤,其机制可能与激活TGF-β/Smad信号通路有关。

人皮肤微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定

背景:目前,国内外研究多采用酶消化法结合免疫磁珠法分离微血管内皮细胞,然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而,如何简化人皮肤微血管内皮细胞分离、培养,同时又能获得到高纯度的内皮细胞体外培养方法成为研究热点。目的:探索一种简便高效的来源于糖尿病患者皮肤微血管内皮细胞的体外培养方法,观察细胞生长状态并进行鉴定。方法:利用临床上糖尿病伴足部慢性创面截肢后,肢体近心端皮肤和局部创面周围皮肤真皮浅层组织。经剪碎后采用贴壁法和短时少量应用胰酶法得到人皮肤微血管内皮细胞,传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。结果与结论:1实验成功获取人皮肤微血管内皮细胞,原代培养的人皮肤微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁,第10天进入对数生长期,第12至13天细胞浓度达80%,传代细胞较原代细胞生长活跃,培养5-7 d可长满培养瓶底,呈"铺路石样"排布;2免疫组织化学染色结果显示,培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原呈阳性,细胞阳性率达100%;3MTT法测得培养第2、4、5代人皮肤微血管内皮细胞的生长曲线呈倒"S"形。4结果证实,应用贴壁法,并在培养过程中少量短时应用胰酶法,可获得大量高纯度的人皮肤微血管内皮细胞。

真皮纤维化疾病的微血管改变及其意义

微血管及其内皮细胞结构和功能的改变不仅是真皮纤维化疾病病理和病理生理变化的一部分,还参与了真皮纤维化的发生和发展。微血管改变可导致组织低氧,低氧又能影响内皮细胞和成纤维细胞的功能,从而参与纤维化进程。纤维化皮损中内皮细胞表达某些细胞因子和粘附分子,可直接或间接促进成纤维细胞的活化。对纤维化皮损血液循环情况的监测,不但能协助判断病情,还有助于评价疗效。

凉血活血胶囊含药血清对微血管异常生成的影响

目的观察临床治疗银屑病的经验方凉血活血胶囊含药血清对微血管异常生成的作用,探讨其治疗银屑病的作用机制。方法以鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)为模型观察凉血活血胶囊含药血清对血管生成的影响;采用碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导的人真皮微血管内皮细胞株(human dermal microvascular endothelial cells,HDMEC)异常增生模型,以cck-8比色法测定凉血活血胶囊含药血清对其增生的影响;采用transwell细胞迁移、体外管腔形成方法观察凉血活血胶囊含药血清对HDMEC迁移及管腔形成能力的影响。结果与相同浓度的空白血清组相比,5%、10%、15%的凉血活血胶囊含药血清均在不同程度上抑制CAM血管新生(分别P<0.05,P<0.01);对HDMEC增生也表现出一定的抑制作用(分别P<0.05,P<0.01);均可抑制HDMEC的迁移(P<0.01);并可显著抑制HDMEC的管腔形成(P<0.01)。结论凉血活血胶囊含药血清可抑制CAM血管新生、对异常HDMEC的增生、迁移、微血管管腔形成均有抑制作用,提示凉血活血胶囊作用于血管异常生成环节,可能是临床治疗银屑病的作用机制之一。

重组人血管内皮抑素联合NP方案对人乳腺癌裸鼠移植瘤作用的实验研究

目的:探讨重组人血管内皮抑素(Recombinanthumanendostatin,rh-ES)联合长春瑞滨+顺铂(NP方案)化疗对人乳腺癌裸鼠移植瘤的肿瘤生长及新生血管生成的抑制作用。方法:将40只荷瘤裸鼠随机分成NP方案组(A组)、rh-ES组(B组)、联合用药组(C组)和空白对照组(D组),每组10只。A组给予NP方案化疗1周期,B组给予rh-ES 2周期,C组给予rh-ES两周期加NP方案1周期,D组给予等剂量生理盐水。其中,rh-ES连续用药14 d为1周期,间隔7 d后重复1周期。计算各组抑瘤率,绘制肿瘤生长曲线。肿瘤组织进行免疫组化法染色,测各组血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及微血管密度(Microvascular density,MVD)的表达。结果:A、B、C 3组抑瘤率分别为61.80%、64.79%、88.95%,C组抑瘤率明显高于其它两组。C组与A、D两组比较VEGF表达,具有显著的统计学差异(P值均为0.001)。C组与A、B、D 3组比较MVD,P值分别为0.000,0.006和0.000,均具有统计学意义。结论:rh-ES联合NP方案化疗能明显抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤生长及新生血管生成,且两者联用具有协同作用。

pH值对人真皮微血管内皮细胞成管的影响及其分子机制

目的探讨pH值对人真皮微血管内皮细胞(HDMEC)成管的影响并研究其分子机制,为促进创面愈合过程中血管新生的研究提供理论依据。方法采用实验研究方法。取第4、5代对数生长期HDMEC进行实验,制备pH值分别为6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8的培养液,用其适应性培养细胞(培养方式下同)24 h后进行后续实验。另培养36 h,采用流式细胞仪测定胞质pH值的相对荧光值并对胞质pH值的相对荧光值与培养液pH值进行相关分析。另培养1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 d,采用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖活性。采用Oris^(TM)细胞迁移检测试剂盒检测去掉播种塞后0(即刻)、24、48 h细胞迁移剩余面积。进行三维基质胶细胞成管实验,检测另培养48 h细胞成管的管腔直径。另培养48 h,采用蛋白质印迹法检测细胞中蛋白激酶B(Akt)磷酸化位点473、308的蛋白表达。样本数均为3。对数据行Pearson相关性分析、单因素方差分析、析因设计方差分析、重复测量方差分析与Bonferroni校正。结果另培养36 h,与pH值6.4培养液相比,pH值6.8~7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著升高(P<0.05);与pH值6.6~7.0培养液相比,pH值7.4~7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著升高(P<0.05),且pH值6.6培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值明显低于pH值7.0、7.2培养液(P值均<0.05);pH值7.6、7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著高于pH值7.2、7.4培养液(P<0.05)。胞质pH值的相对荧光值与培养液pH值呈显著正相关(r=0.99,P<0.05)。8种pH值培养液另培养1.5 d细胞增殖活性相近(P>0.05)。另培养2.5 d,与pH值7.6培养液相比,pH值6.4~6.8培养液培养细胞增殖活性均显著下降(P<0.05)。另培养3.5 d,与pH值6.4~6.8培养液相比,pH值7.0~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高(P<0.05);与pH值7.6培养液相比,pH值7.0~7.4、7.8培养液培养细胞增殖活性均显著下降(P<0.05)。另培养4.5、5.5 d,与pH值6.4培养液相比,pH值6.8~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高(P<0.05);与pH值6.6、6.8培养液相比,pH值7.0~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高(P<0.05)。另培养4.5 d,pH值7.6培养液培养细胞增殖活性显著高于pH值7.0培养液(P<0.05)。另培养5.5 d,与pH值7.0培养液相比,pH值7.2~7.6培养液培养细胞增殖活性均显著升高(P<0.05);与pH值7.2、7.4培养液相比,pH值7.6培养液培养细胞增殖活性显著升高(P值均<0.05),pH值7.8培养液培养细胞增殖活性显著降低(P值均<0.05)。去掉播种塞后0 h,8种pH值培养液培养细胞迁移剩余面积相近(P>0.05)。去掉播种塞后24 h,与pH值6.4培养液相比,pH值6.6~7.8培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小(P<0.05);与pH值6.6、6.8培养液相比,pH值7.0~7.6培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小(P<0.05)。去掉播种塞后48 h,与pH值6.4、6.6培养液相比,pH值7.0~7.8培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小(P<0.05);pH值7.2、7.4培养液培养细胞迁移剩余面积均显著小于pH值6.8、7.0、7.8培养液(P<0.05),均显著大于pH值7.6培养液(P<0.05);pH值7.6培养液培养细胞迁移剩余面积显著小于pH值6.8、7.8培养液(P值均<0.05)。另培养48 h,pH值7.0、7.2、7.4、7.6、7.8培养液培养细胞成管的管腔直径分别为(5.0±0.5)、(7.6±0.9)、(8.5±0.7)、(11.0±0.8)、(5.3±0.8)μm,均显著长于pH值6.4培养液的(2.8±0.8)μm(P<0.05);pH值6.6[(4.2±0.3)μm]、6.8[(4.5±0.6)μm]、7.0、7.8培养液培养细胞成管的管腔直径均显著短于pH值7.6培养液(P<0.05)。另培养48 h,与pH值6.4、6.6培养液相比,pH值6.8~7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473、308蛋白表达均明显升高(P<0.05),且pH值6.6培养液培养细胞中Akt磷酸化位点308蛋白表达明显高于pH值6.4培养液(P<0.05);与pH值6.8培养液相比,pH值7.0、7.4~7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473蛋白表达均明显升高(P<0.05);与pH值7.6培养液相比,pH值7.0~7.4、7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473蛋白表达均明显降低(P<0.05);与pH值7.8培养液相比,pH值7.0~7.6培养液培养细胞中Akt磷酸化位点308蛋白表达均明显升高(P<0.05)。结论pH值可调控HDMEC形成毛细血管的管腔直径,该调控作用与Akt的激活密切相关;7.2~7.6为构建组织工程毛细血管的适宜pH值。

阿司匹林对人胃癌细胞株的作用及机制探讨

目的 观察阿司匹林对人胃癌细胞株SGC7901生长及人胃癌裸鼠移植瘤生长的作用,并初步探讨其作用机制。方法 采用MTT法及流式细胞术检测不同浓度阿司匹林对胃癌细胞增殖及细胞周期的影响;Westem blot法检测阿司匹林对胃癌细胞COX-2、VEGF表达的影响;建立人胃癌裸鼠移植瘤模型,给予阿司匹林20天,观察肿瘤大小,免疫组化检测阿司匹林对肿瘤组织中COX-2、VEGF表达及MVD的影响。结果 阿司匹林对胃癌细胞的增殖具有抑制作用,且呈一定的时间、剂量依赖性;细胞周期分析表明阿司匹枳主要使细胞阻滞在G0/G1期;western blot检测表明阿司匹林能降低胃癌细胞COX-2、VEGF蛋白的表达;阿司匹林对裸鼠移植瘤的生长有抑制作用,免疫组化显示阿司匹林能降低移植瘤组织中(COX-2、VEGF的表达及MVD。结论 阿司匹林对胃癌细胞及裸鼠移植瘤均具有一定的抑制作用,其机制可能是通过对COX-2和VEGF等血管生成相关因子的抑制起作用。

永生化小鼠Bend.3细胞株具有脑微血管内皮细胞的屏障特性

目的评价永生化小鼠脑微血管内皮细胞株Bend.3是否具有脑微血管内皮细胞的屏障特性。方法将小鼠脑微血管内皮细胞株Bend.3接种于细胞培养插内,跨内皮细胞电阻抗(transendothelial electrical resist-ance,TEER)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)通透性实验检测其屏障功能。Western blot法和直接荧光染色法观察其紧密连接相关蛋白Occludin、ZO-1的表达及细胞骨架蛋白F-actin的分布。结果 Bend.3细胞的TEER随培养时间延长逐渐升高,10d达82.3±6.0Ω.cm2,与培养3d时的37.3±3.1Ω.cm2相比,差异有统计学意义(P<0.05)。其培养10d和3d的平均HRP通透率在120min分别为(2.2±0.05)%和(4.3±0.20)%,差异有统计学意义(P<0.05)。培养10d时该细胞表达高浓度的紧密连接蛋白Occludin、ZO-1,且F-actin主要分布在细胞周边,线条完整连续,未见明显缝隙形成。结论小鼠脑微血管内皮细胞株Bend.3具有脑微血管内皮细胞的屏障特性,且其屏障功能在接种10d后可达到最理想的状态。

色素上皮衍生因子在创面中的表达变化及对人真皮微血管内皮细胞的作用与机制

目的探讨色素上皮衍生因子(PEDF)在创面愈合过程中的表达变化情况以及对人真皮微血管内皮细胞(hDMEC)的作用和潜在机制。方法运用生物信息学方法,通过NCBI GEO数据库行基因芯片分析,明确PEDF在创面愈合过程中表达变化情况;选择3只SD大鼠,制作创面模型,收集皮肤组织样本进行实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测,验证PEDF在创面愈合过程中表达变化情况;细胞划痕试验探究PEDF对hDMEC迁移能力的影响,细胞计数试剂盒(CCK)-8试验探究PEDF对hDMEC增殖能力的影响,成管实验探究PEDF对hDMEC血管形成能力的影响;STRING预测PEDF-蛋白间相互作用关系,最终通过蛋白质印迹法检测PEDF与hDMEC Wnt/β-catenin通路间关系。数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果(1)R语言分析基因芯片GSE28914人皮肤正常创面愈合过程中PEDF变化情况,发现人正常皮肤组织中PEDF表达量为-0.04±0.03,而人皮肤正常创面愈合过程中,PEDF在凝血期(创后即刻)一过性升高(0.84±0.12),比较差异有统计学意义(差异倍数=0.89,P=0.002),炎症期(创后第3天)迅速下降(-0.60±0.09),比较差异有统计学意义(差异倍数=-0.55,P=0.010),最终逐渐恢复到正常皮肤水平(0.03±0.06),比较差异有统计学意义(差异倍数=-0.07,P=0.602);(2)SD大鼠皮肤组织PEDF表达量高于创后第3天,SD大鼠皮肤中PEDF的RNA相对表达量为1.15±0.13,创后第3天SD大鼠创面组织中PEDF的RNA相对表达量为0.45±0.04,比较差异有统计学意义(t=9.21,P<0.001)。SD大鼠皮肤组织中相对PEDF蛋白表达水平为1.32±0.15,创后第3天SD大鼠创面组织中PDEF蛋白表达水平为0.83±0.08,比较差异有统计学意义(t=5.11,P<0.001);(3)PEDF抑制hDMEC迁移能力,siPEDF组、rPEDF组、对照组的内皮细胞迁移率分别是(92.01±3.04)%、(19.51±3.93)%、(57.03±1.065)%,3组比较差异有统计学意义(F=459.30,P<0.001)。siPEDF组的迁移率明显高于对照组,差异有统计学意义(t=25.29,P<0.001),rPEDF组的迁移率明显低于对照组,差异有统计学意义(t=15.98,P<0.001)。siPEDF组内皮细胞迁移率为对照组2倍,rPEDF组内皮细胞迁移率为对照组的1/3;(4)PEDF抑制hDMEC增殖能力,siPEDF组、rPEDF组、对照组的内皮细胞增殖率分别是(442.60±58.90)%、(248.90±52.19)%、(333.80±47.70)%,3组比较差异有统计学意义(F=16.69,P<0.001)。siPEDF组的增殖率明显高于对照组,差异有统计学意义(t=3.21,P=0.013),rPEDF组的增殖率明显低于对照组,差异有统计学意义(t=2.69,P=0.028);(5)PEDF抑制hDMEC成管能力:siPEDF组、rPEDF组、对照组的内皮细胞成管结点数分别是(38.00±4.58)、(11.33±3.51)、(23.67±6.66)个,3组比较差异有统计学意义(F=20.64,P=0.002),siPEDF组的成管结点数明显多于对照组,差异有统计学意义(t=3.07,P=0.037),rPEDF组的成管结点数明显少于对照组,差异有统计学意义(t=2.84,P=0.047);siPEDF组、rPEDF组、对照组的成管长度分别是(1518.00±250.90)、(365.8±91.52)、(925.50±193.00)ppi,3组比较差异有统计学意义(F=27.53,P<0.001),siPEDF组的成管长度明显长于对照组,差异有统计学意义(t=3.24,P=0.032),rPEDF组的成管长度明显短于对照组,差异有统计学意义(t=4.54,P=0.011);(6)PEDF与经典Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白存在相互作用,STRING预测蛋白-蛋白之间的相互作用关系,发现PEDF与Wnt/β-catenin信号通路之间存在共同作用蛋白;(7)PEDF抑制Wnt1、β-catenin蛋白表达,siPEDF组、rPEDF组、对照组hDMEC中Wnt1蛋白相对表达水平分别为0.84±0.04、0.12±0.05、0.66±0.08,3组比较差异有统计学意义(F=114.80,P<0.001),siPEDF组的Wnt1的蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(t=4.95,P=0.036),rPEDF组的Wnt1的蛋白表达水平明显低于对照组,差异有统计学意义(t=13.94,P=0.005);siPEDF组、rPEDF组、对照组β-catenin蛋白相对表达水平分别为0.77±0.05、0.50±0.07、0.63±0.06,3组比较差异有统计学意义(F=15.04,P=0.005),siPEDF组的β-catenin的蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(t=6.51,P=0.023),rPEDF组的β-catenin的蛋白表达水平明显低于对照组,差异有统计学意义(t=4.56,P=0.045)。结论PEDF随着创面愈合过程,其表达呈动态的变化;PEDF可能通过调节Wnt/β-catenin通路,进而抑制hDMEC的迁移、增殖与成管,最终影响创面愈合。

低氧条件下沉默HIF-1α与TNF-α、IL-6的相关性研究及人真皮微血管内皮细胞生物学行为的变化

该文探讨了低氧条件下沉默缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)的相关性及人真皮微血管内皮细胞生物学行为的变化。采用三气培养箱培养人真皮微血管内皮细胞,根据时间和氧浓度分组,确定最适培养时间及缺氧浓度。同时,构建靶向HIF-1α的腺病毒并感染人真皮微血管内皮细胞,分为对照组、空载组和沉默组。应用RT-PCR和Western blot检测HIF-1α、TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白质水平。Transwell检测细胞迁移能力,流式细胞技术观察细胞凋亡及细胞周期变化。结果显示,缺氧条件下,HIF-1α、TNF-α和IL-6的表达随缺氧时间延长而增加,随氧浓度降低而增加。与对照组相比,沉默组的细胞迁移能力(P<0.01)及周期(P<0.01)均明显抑制,细胞凋亡明显增加(P<0.01)。与对照组相比,沉默组TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白质水平均减少(P<0.01)。由此可见,缺氧条件下,HIF-1α、TNF-α和IL-6的表达呈时间依赖性和氧浓度递减依赖性。人真皮微血管内皮细胞HIF-1α的表达与炎性因子TNF-α、IL-6具有明显的正相关。沉默HIF-1α后,能明显抑制细胞增殖,抑制细胞迁移,促进细胞凋亡。