肿瘤坏死因子-α对体外培养的人眼小梁细胞基质金属蛋白酶-3和基层金属蛋白酶-9表达的影响

目的探讨肿瘤坏死因子-α,(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对体外培养的人眼小梁细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP-3、MMP-9)表达的影响。方法对人眼小梁细胞(human trabecular cells,HTCS)进行体外原代培养及传代培养。取传3代的小梁细胞分别施加含TNF-α终浓度为0(对照组)、1mg/ml、10mg/ml、25ng/ml的无血清培养液,48h后采用免疫细胞化学法观察小梁细胞MMP-3、MMP-9的染色变化。对结果进行计算机图像分析并进行统计学检验。结果利用免疫细胞化学法检测1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml的TNF-α实验组小梁细胞MMP-3的平均灰度值分别为138.63±8.15、138.73±7.02、129.25±10.47,均低于对照组平均灰度值143.53±6.01,且各实验组与对照组比较差异均有显著性(P<0.05);实验组小梁细胞MMP-9的平均灰度值分别为137.60±11.53、125.20±17.29、119.88±12.47,均低于对照组平均灰度值145.30±7.05,且各实验组与对照组比较差异均有显著性(P<0.05)。结论TNF-α在一定范围内促进小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达,增加了小梁网异常堆积的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的降解,使房水流出增加,眼压降低。

人眼小梁细胞体外培养与细胞鉴定

目的:建立人眼小梁细胞体外培养方法和确定该细胞的鉴定要点。方法:小梁网和角巩膜组织来源于除眼部疾患以外各种原因死亡的6岁以下儿童,在24小时内取材的34人68只正常眼球。组织块原代培养和细胞传代培养。用光镜和电镜观察培养细胞;用免疫组织细胞化学S-P法染色培养细胞的细胞外基质包括纤粘连蛋白(fibronectin,FN)、层粘连蛋白(laminin,LN)和Ⅳ型胶原(Ⅳ collagen,ⅣC)。结果:供者年龄小、取材距死亡时间短者小梁细胞易生长;分离小梁网必须准确;原代培养的接种与换液和传代培养的时机与比例应适当;实验研究选用传3～5代细胞。培养的小梁细胞生长特性和形态特征不同于角巩膜组织的细胞;超微结构使其与角膜基质细胞相鉴别;细胞外基质染色使其与巩膜成纤维细胞相鉴别。结论:本研究表明,只要掌握培养方法和要点,人眼小梁细胞体外培养在常规培养条件下并不困难。对培养的人眼小梁细胞鉴定至少从其生长特性,形态特征和细胞外基质(FN,LN和ⅣC)免疫组织细胞化学S-P法染色特点三方面相结合方能确定小梁细胞。建立人眼小梁细胞体外培养方法与细胞鉴定是进一步研究原发性开角型青光眼病因和发病机制的必要条件和重要保证。眼科学报1998;14:190～194。

转化生长因子β_1对培养人眼小梁细胞分泌Ⅳ型胶原的影响

目的:观察转化生长因子β_1(transforming growth factor-β_1,TGF-β_1)对培养人眼小梁细胞分泌Ⅳ型胶原的影响。方法:在成功地培养人眼小梁细胞的基础上,应用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbentassay ELISA)及免疫组织化学技术,分别观察1ng/ml TGF-β1作用于小梁细胞后培养上清液中及细胞铺片上Ⅳ型胶原的含量。结果:ELISA法:TGF-β_1作用第一个4天,实验组Ⅳ型胶原的含量为187.50±29.01pg/ml(x±s),对照组为93.75±20.56pg/ml,两者间的差异有统计学意义。TGF-β_1作用第二个4天,实验组为128.75±52.02pg/ml,对照组为91.25±21.36pg/ml,差异无统计学意义。Ⅳ型胶原的含量在对照组之间及实验组之间也无统计学差异。免疫组化法:TGF-β_1作用12天,实验组铺片与对照组相比Ⅳ型胶原的阳性着色增强。结论:TGF-β_1可以促进培养的人眼小梁细胞分泌Ⅳ型胶原,它可能是原发性开角型青光眼患者小梁细胞外基质堆积的原因之一。眼科学报2000;16:217～219。

体外培养人眼小梁细胞Ang Ⅱ的表达

目的探讨血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)在体外培养的人眼小梁细胞(TMC)中的表达情况。方法原代和传代培养人眼TMC株,收集第3代人眼TMC用于制作细胞爬片。利用免疫组织化学染色法和Western blot法检测体外培养人眼TMC中AngⅡ蛋白的表达。结果传代培养的人眼TMC呈典型梭形,免疫组织化学检测显示体外培养的人眼TMC细胞膜和细胞质中可见AngⅡ的阳性颗粒,阴形对照片中未见有Ang Ⅱ蛋白表达。Western blot法在相对分子质量为64000处可见一明显蛋白条带,为Ang Ⅱ蛋白的阳性表达。结论Ang Ⅱ在体外培养的人眼TMC中呈阳性表达,提示AngⅡ可能参与青光眼眼压和房水循环的调节。

溶血磷脂酸对人眼小梁细胞纤维连接蛋白、层粘连蛋白合成的影响

目的:观察溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对人眼小梁细胞纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及层粘连蛋白(laminin,LM)合成的影响。方法:取体外培养的第3代人眼小梁细胞,随机分为实验组和对照组。实验各组经10、20、50umol/L的LPA作用48小时后,分别用酶联免疫吸附法、鼠抗人LM单克隆抗体进行免疫组织化学检测法测定实验各组和对照组小梁细胞FN、LM的合成。结果:10、20、50umol/L的LPA均可促进人眼小梁细胞合成FN,A值分别为0.33±0.08、0.52±0.06、0.83±0.04,与对照组0.21±0.04相比,差别有统计学意义(p<0.05);10、20、50umol/L的LPA均可促进人眼小梁细胞合成LM,A450值分别为0.32±0.05、0.51±0.06、0.82±0.07,与对照组0.20±0.08相比,差别有统计学意义(p<0.05)。结论:LPA能促进人眼小梁细胞合成FN、LM,可能通过影响小梁细胞合成细胞外基质,导致房水外流阻力,参与原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)的发病过程。

白细胞介素-1β对人眼小梁细胞基质金属蛋白酶-3表达的影响

目的观察白细胞介素-1β(IL-1β)对体外培养的人眼小梁细胞基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinases3,MMP-3)表达的影响。方法采用组织块培养法对人眼小梁细胞(human trabecular cells,HTCs)进行体外原代及传代培养,取传3代小梁细胞分别加入含有IL-1β终浓度为0ng/ml(对照组)、5、10、25、50ng/ml的无血清培养液,24h后采用RT-PCR法及ELISA法检测MMP-3量的变化。结果RT-PCR法检测IL-1β终浓度为5、10、25、50ng/ml实验组MMP-3/GAPDH的相对灰度比值分别为0.3437±0.0764、0.8588±0.0443、1.0079±0.0347、1.3466±0.0309,均高于对照组的相对灰度比值0.1037±0.0494,且各实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);ELISA法检测IL-1β终浓度为5、10、25、50ng/ml实验组的MMP-33浓度值分别为(2.0325±0.2456)ng/ml、(2.4607±0.350)ng/ml、(2.8532±0.1392)ng/ml、(3.5858±0.1141)ng/ml,均高于对照组的浓度值(1.2437±0.3910)ng/ml,且各实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论IL-1β在一定范围内促进MMP-3的表达,并且呈现一定的剂量依赖性,推测IL-1β可以通过促进MMP-3的表达来减少小梁网组织细胞外基质(ECM)的堆积,使房水引流通畅,降低眼内压。

人眼小梁细胞体外培养及传代实验

目的探索体外培养人眼小梁细胞的方法，为进一步研究原发性开角型青光眼的发病机理提供实验的依据。方法用器官培养及组织块培养两种方法，进行人眼小梁细胞的原代培养和传代实验，并同时对照培养人眼巩膜成纤维细胞，对二者从形态学上进行比较。结果（１）器官培养较单纯组织块培养更易获得原代小梁细胞；（２）传３～５代人眼小梁细胞处于最稳定阶段，可利用此阶段细胞进行多种体外实验。结论体外培养人眼小梁细胞可获得生长形态及特征稳定的小梁细胞。