COL4A1促进肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化

目的探讨Ⅳ型胶原蛋白1(COL4A1)对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)的作用,及其上游调控机制。方法将COL4A1过表达载体、人着色性干皮病基因(XPD)过表达载体、miR-29a-3p模拟物、miR-29a-3p抑制物、Si-COL4A1、Si-XPD按实验目的转染各组细胞,以空载质粒、NC-模拟物、NC-抑制物、NC-SiRNA作为相应的对照组;qRT-PCR检测COL4A1和XPD mRNA水平;蛋白质印迹法检测COL4A1、XPD和EMT相关蛋白质水平;MTT检测细胞活力;Transwell实验检测各组细胞的迁移、侵袭能力;萤光素酶报告基因实验验证miR-29a-3p和COL4A1的靶向关系。结果肝癌组织中COL4A1 mRNA[(3.25±1.10)vs(0.88±0.45),P<0.01]和蛋白质[(2.58±0.50)vs(1.00±0.14),P<0.01]水平均高于癌旁组织。SMMC-7721、HepG2(P<0.01)和Hep3B(P<0.05)细胞株的COL4A1 mRNA和蛋白质水平均高于L02细胞。与Hep3B+空载质粒相比,过表达COL4A1促进了Hep3B细胞增殖[(0.48±0.06)vs(0.76±0.09),P<0.01]、迁移[(109.00±9.17)个vs(199.33±15.04)个,P<0.01]、侵袭[(84.67±8.02)个vs(133.00±11.53)个,P<0.01]和EMT(P<0.05)。与HepG2+NC-SiRNA相比,沉默COL4A1抑制了HepG2细胞增殖[(0.62±0.09)vs(0.42±0.03),P<0.01]、迁移[(173.00±12.00)个vs(75.00±7.94)个,P<0.01]、侵袭[(105.33±7.51)个vs(47.00±5.57)个,P<0.01]和EMT(P<0.05)。过表达XPD后,HepG2细胞的COL4A1 mRNA[(1.00±0.09)vs(0.55±0.06),P<0.01]和蛋白质[(1.00±0.09)vs(0.33±0.04),P<0.01]水平较HepG2+空载质粒组下降,沉默XPD在Hep3B细胞中出现了相反的结果[与Hep3B+NC-SiRNA相比:mRNA,(1.00±0.08)vs(2.52±0.25);蛋白质,(1.00±0.09)vs(2.56±0.36),P<0.01]。转染miR-29a-3p模拟物后,HepG2细胞中COL4A1 mRNA[(1.00±0.13)vs(0.47±0.07),P<0.01]和蛋白质[(1.00±0.15)vs(0.36±0.09),P<0.01]水平较NC-模拟物+HepG2下降;而miR-29a-3p抑制物在Hep3B细胞中出现了相反的结果[与NC-抑制剂+Hep3B相比:mRNA,(1.00±0.13)vs(3.30±0.41),P<0.01;蛋白质,(1.00±0.14)vs(2.91±0.30),P<0.01]。miR-29a-3p模拟物逆转了沉默XPD介导的Hep3B细胞COL4A1上调(P<0.01)。结论COL4A1促进肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT,并受XPD-miR-29a-3p轴的负性调控。

人剪切修复基因XPD对肝癌细胞P53和Ets-1基因的作用

目的探讨人剪切修复基因XPD对肝癌细胞P53和Ets-1基因的影响。方法使用脂质体瞬时转染技术,将pEGFP-N2-XPD重组质粒转染至肝癌细胞HepG2,24 h后加入20μmol/L的P53抑制剂Pifithrin-α,孵育24 h,并以未经转染的HepG2细胞作为空白对照。RT-PCR、Western blot检测细胞中XPD、P53、phosphoP53(ser-15)、Ets-1的mRNA和蛋白的表达变化,MTT法观察细胞增殖的活力,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果与空白对照比较,转染pEGFP-N2-XPD重组质粒后,HepG2细胞XPD、P53 mRNA和蛋白表达上调(P<0.01),而Ets-1 mRNA和蛋白表达下调(P<0.01),加入Pifithrin-α后,XPD、P53 mRNA和蛋白表达下调,Ets-1mRNA和蛋白表达上调(P<0.01)。转染pEGFP-N2-XPD重组质粒后,HepG2细胞进入S期发生阻滞,停滞在G1期(P<0.01),加入Pifithrin-α后,HepG2细胞G1期细胞减少,S期细胞增多(P<0.01)。转染pEGFP-N2-XPD重组质粒后,HepG2细胞增殖活力下降(P<0.01),加入Pifithrin-α后,HepG2细胞增殖活力上升(P<0.01)。结论野生型XPD基因在转染至肝癌HepG2细胞后,可以上调P53的表达,通过P53途径抑制Ets-1的表达,促使肝癌细胞凋亡。

XPD/ERCC2 mRNA在柔红霉素处理的THP-1细胞系及急性髓系白血病患者中表达的研究

目的探讨柔红霉素对人着色性干皮病基因组D(XPD)[又称切除修复交叉互补基因2(ERCC2)]的影响,以及XPD/ERCC2基因与急性髓系白血病发病、缓解的相关性。方法检测并比较急性髓系白血病THP-1细胞系采用不同浓度(0.025、0.05、0.25、1.25μmol/L)、不同作用时间(12、24 h)柔红霉素处理后的XPD/ERCC2 mRNA的相对表达量。检测并比较急性髓系白血病初诊组(26例)、完全缓解组(21例)及缺铁性贫血(35例)三组患者骨髓单个核细胞XPD/ERCC2 mRNA的相对表达量。结果 THP-1细胞系用0.025、0.05、0.25、1.25μmol/L浓度盐酸柔红霉素处理12 h时,XPD/ERCC2 mRNA相对表达量分别是0.949±0.184、1.738±0.495、1.629±0.191、2.376±0.908,处理24 h时相对表达量分别为1.394±0.128、2.298±0.698、2.318±0.089、4.156±1.617,THP-1细胞系XPD/ERCC2 mRNA相对表达量随柔红霉素浓度的递增和作用时间的递增而递升,差异有统计学意义(P均<0.05)。初诊组、完全缓解组、缺铁性贫血组患者髓单个核细胞中XPD/ERCC2 mRNA相对表达量比较无统计学差异(P>0.05)。结论 XPD/ERCC2 mRNA在THP-1细胞系中的相对表达量,随柔红霉素药物浓度增加而增加,随药物作用时间增加而增加,其表达与急性髓系白血病患者的发病、缓解无相关性。