人硫氧还蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及对内毒素血症小鼠的保护作用

为了对人硫氧还蛋白hTRX功能及其在休克治疗前景进行评价 ,将PCR扩增的hTRX基因连入pKPL 4载体 ,转化大肠杆菌pop2 136 .通过两步离子交换柱分离得到纯化的蛋白 ,进一步观察其稳定性及在体外对NFS 6 0和MCF 7细胞的促增殖活性 .结果发现 ,TRX蛋白可明显促进去细胞因子诱导的NFS 6 0细胞增殖和撤血清后MCF 7细胞的增殖 ,并发现外源性TRX可明显对小鼠内毒素血症起保护作用 .

人硫氧还蛋白对脑缺血作用的CT灌注与SOD相关性的实验研究

目的研究人硫氧还蛋白(hTRX)对局灶性兔脑缺血/再灌注损伤后脑组织的保护作用,并探讨其清除氧自由基的生物学活性.方法采用线栓法制成一侧兔脑缺血/再灌注模型(栓塞6 h,再灌注18 h),将25只雄性新西兰白兔随机分成假手术组(Sham组,5只)、缺血/再灌注组(I/R组,10只)和缺血/再灌注+hTRX治疗组(I/R+hTRX组,10只),I/R+hTRX组给予hTRX(0.75 mg/kg体质量),Sham组、I/R组以等容积的生理盐水取代hTRX;分别于梗死后6 h及再灌注后18 h做CT灌注图像,观察脑梗死面积,计算出其所占同侧大脑半球面积的百分比(HLA%);检测脑组织匀浆中SOD,MDA含量.结果脑缺血/再灌注后,脑梗死范围显著,脑组织匀浆中SOD明显下降,MDA明显升高(与假手术组比较,P<0.01);而应用hTRX能显著减小脑梗死面积,降低MDA及升高SOD含量(与B组比较,P<0.01).结论重组hTRX对脑缺血/再灌注损伤有显著的治疗作用.

人硫氧还蛋白在兔脑缺血再灌注损伤中的作用

目的 通过CT灌注及测量脑水肿程度 ,观察人硫氧还蛋白 (hTRX)对局灶性兔脑缺血 /再灌注损伤的保护作用。方法 采用线栓法制成一侧兔脑缺血 /再灌注模型 (栓塞 6h ,再灌注 18h) ,将 2 5只雄性新西兰白兔随机分成假手术组 ( 5只 )、缺血 /再灌注组 ( 10只 )和缺血 /再灌注 +hTRX组 ( 10只 ) ,后者给予hTRX( 0 .75mg/kg体重 ) ,其他组给予等容积的生理盐水。分别于梗死后 6h及再灌注后 18h做CT灌注图像 ,计算脑梗死面积占同侧同层大脑半球面积的百分比 ;测量脑组织含水量。结果 脑缺血 /再灌注后 ,应用hTRX治疗 ,脑梗死面积显著减少 ,脑水肿减轻。结论 重组hTRX对脑缺血

人硫氧还蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人硫氧还蛋白基因的重组真核表达载体。方法人硫氧还蛋白的cDNA克隆至pGEM-TEasy载体,经DNA测序证明后,将其克隆至真核表达载体pShttle构建重组pShttle-hTRX,pShttle-hTRX转染Hela细胞系进行瞬时表达,通过Westernblot、免疫组化、活性测定、酶切、PCR扩增等方法证实构建载体的正确性。结果构建携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体pShttle-hTRX,转染HeLa细胞后可检测到hTRX的转录和表达。结论正确构建了携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体,本结果可用于探讨硫氧还蛋白的生物学作用。

人硫氧还蛋白基因分子克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人硫氧还蛋白(hTRX)cDNA序列并进行真核表达载体的构建。方法应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中;经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定。结果将所得序列与GenBank(J04026)提供的序列比较,其酶活性中心(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确。结论成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX。

人硫氧还蛋白基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆人硫氧还蛋白(hTRX)cDNA序列,进行真核表达载体的构建。方法应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中,经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定;利用阳性脂质体Lipofectamine将其转入COS-7细胞(瞬时表达细胞),RT-PCR检测其表达情况。结果将所得序列与GenBank(J04026)提供的序列比较,其酶活性中心(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确;COS-7细胞中有hTRX的表达。结论成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,并在COS-7细胞中得到了表达,为进一步探讨hTRX的生物活性和应用奠定了基础。

人硫氧还蛋白对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用及机制

目的探讨人硫氧还蛋白(hTrx)对肺缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用及可能机制。方法将健康清洁级Wistar大鼠84只随机分为对照组12只、I/R组和Trx组各36只,后两组复制I/R肺损伤模型,Trx组于缺血前10 min和再灌注前10 min腹腔注射重组hTrx注射液0.75 mg/kg。于再灌注1、3、5 h分别取三组肺组织检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)含量;原位缺口末端标记(TUNEL)法测定细胞凋亡指数(AI);原位杂交法检测Caspase-3 mRNA表达。结果 I/R组各时点MDA含量、细胞AI和Caspase-3 mRNA表达均显著高于对照组(P均<0.01),而SOD活性则随再灌注时间延长有所降低;Trx组MDA含量、AI、Caspase-3 mRNA表达均显著低于I/R组(P均<0.01)。AI与MDA、Caspase-3 mRNA呈显著正相关(r分别为0.844,0.775,P均<0.01);与SOD呈显著负相关(r为-0.820,P<0.01)。结论 Trx对I/R后肺组织细胞凋亡具有抑制作用;其机制可能与清除自由基、抑制脂质过氧化、下调Caspase-3 mRNA表达有关。

一种人硫氧还蛋白基因修饰肝细胞的制备

【目的】制备出一种人硫氧还蛋白(hTrx)基因修饰的肝细胞。【方法】逆转录聚合酶链反应法扩增出hTrxcDNA,应用重组逆转录病毒制备hTrx基因修饰大鼠肝细胞。白蛋白免疫组化SABC法进行肝细胞活性鉴定,MTT比色试验进行抗氧化应激能力检测。【结果】克隆出hTrx开放阅读框cDNA并制备出重组逆转录病毒,感染真核细胞后可分泌融合表达的hTrx并具有生物学活性。制备出hTrx基因修饰大鼠肝细胞,免疫组化SABC法显示肝细胞功能正常,MTT比色法检测具有较强的抗氧化应激能力(P<0.05),并可有效增殖。【结论】成功制备出一种具有较强抗氧化应激的hTrx基因修饰肝细胞。

重组人硫氧还蛋白对大鼠内毒素肺损伤保护作用

目的:探讨重组人硫氧还蛋白1(rh Trx-1)对新生SD大鼠急性内毒素肺损伤的保护作用.方法:制备、鉴定rh Trx-1;将新生SD大鼠分为对照组、脂多糖(LPS)实验组和LPS+rh Trx-1干预组.腹腔注射LPS(质量分数为5 mg/kg),制备急性内毒素肺损伤模型,干预组于LPS注射前30 min腹腔注射rh Trx-1(质量分数为10 mg/kg),观察注射后24 h各组新生SD大鼠的一般情况以及死亡率;重复实验,每组分别于实验后的2、8 h随机处死大鼠,提取肺组织用于病理切片观察.结果:(1)成功制备rh Trx-1;(2)LPS组大鼠表现出活动少,反应差,精神萎靡,毛发无光泽,口周发绀等全身炎症反应症状,濒死状态时表现为毛色青灰,呼吸浅表;LPS+h Trx-1干预组动物症状明显减轻;阴性对照组、LPS实验组和LPS+rh Trx-1干预组大鼠24 h死亡率分别为0%,67%、17%(2=14.400,P=0.001);(3)LPS组肺组织损伤严重,可见肺组织结构不完整,肺泡间隔明显增宽,肺泡腔内有红细胞、炎症细胞及浆液渗出,血管周围组织可见白细胞浸润,毛细血管有明显充血及扩张表现,随时间延长有加重趋势,LPS+rh Trx-1干预组病理改变较内毒素组明显减轻,肺泡结构尚正常,轻度肺水肿,肺泡间隔稍增宽,红细胞渗出明显减少,肺泡及肺间质中白细胞浸润减少.结论:重组人硫氧还蛋白1对急性内毒素肺损伤的新生大鼠具有保护作用.

人硫氧还蛋白基因克隆及其重组逆转录病毒载体的构建和鉴定

目的克隆人硫氧还蛋白(hTRX)基因,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体。方法利用RT-PCR法,以PHA活化的人外周血单个核细胞总RNA为模板,扩增hTRX编码蛋白的cDNA基因,并亚克隆至逆转录病毒载体pSIV-1中进行PCR、双酶切和测序鉴定。结果将所得的序列与GenBank(BC003377)报道的序列比较,其酶活性中心(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)与已知序列一致,第132、136、170、264位碱基与已知序列不同,其中第136、170位相应密码子编码的氨基酸发生了变化(Phe→Leu,Ile→Thr),成功获得了pSIV-1-hTRX重组逆转录病毒载体。结论hTRX基因的克隆及其重组逆转录病毒载体pSIV-1-hTRX的构建,为进一步探讨hTRX的生物学活性和应用奠定了基础。

腹腔积液中人硫氧还蛋白过表达与小儿腹膜间皮细胞炎症的关系探讨

目的探讨腹腔积液中人硫氧还蛋白(human thioredoxin,hTRX)过表达与小儿腹膜间皮细胞炎症的关联。方法实验设计分4组:对照组(B-Z组),rhTRX高剂量组(G-Y组),rhTRX中剂量组(Z-Y组),rhTRXl低剂量组(L-Y组);采用MTT比色法检测小儿腹膜间皮细胞的存活率;用试剂盒进行T淋巴细胞亚群的测定;测定4组小儿腹膜间皮细胞培养上清液中炎性因子IFN-γ的浓度;采用RT-PCR和酶联免疫吸附法测定各组中的干扰素-γ(IFN-γ)基因和蛋白的表达水平。结果与B-Z组相比,L-Y组、Z-Y组和G-Y组IFN-γ浓度下降( P <0.05),随rhTRX剂量的增加,小儿腹膜间皮细胞的存活率升高( P <0.05);RT-PCR和ELISA结果显示L-Y组中IFN-γ的表达水平无明显下降,Z-Y组和G-Y组细胞的IFN-γ表达水平与B-Z组相比有明显下降( P <0.05)。结论 腹腔积液中hTRX过表达对小儿腹膜间皮细胞炎症具有抑制作用。

N末端亲和标签可增进人硫氧还蛋白-1对氧化剂的敏感性

人细胞质硫氧还蛋白(hTrx1)在抗氧化和氧化还原调控中起重要作用.如果静脉注射重组hTrx1,动物抗氧化能力将增高.近年来,随着人们对氧化还原调控的关注,hTrx1需求不断增加.为了快速获得高纯度重组hTrx1,N末端亲和标签,如组氨酸标签(His-tag)和谷胱甘肽S-转移酶标签(GST-tag),被用于hTrx1亲和纯化.带N末端标签的hTrx1融合蛋白在实验中用的越来越多.但N末端延长是否会影响hTrx1特性尚不清楚.我们构建与优化了hTrx1原核表达质粒,在大肠杆菌中高效表达了含天然N末端、带His-tag或带GST-tag的3种重组hTrx1.纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现1条带,对应的分子量分别为12kD、17kD及38kD.在无氧化剂存在时,它们催化胰岛素还原的能力不分仲伯.当有H2O2存在时,天然N末端hTrx1通过形成可逆二聚体,对H2O2表现出较强的耐受性;而N末端亲和标签有干扰二聚体形成,使hTrx1对H2O2耐受性降低的作用,其中GST-tag干扰作用明显大于His-tag.此外,体内重要的氧化还原对GSH/GSSG,有增进hTrx1及其还原酶催化NADPH氧化的作用,N末端亲和标签可明显扩大GSH/GSSG的这种作用.我们分析了N末端亲和标签对hTrx1活性影响的可能机理.

抗人硫氧还蛋白-1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用

目的:制备抗硫氧还蛋白-1(TRX-1)的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:以原核表达的TRX-1为抗原免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析,用Westernblot法对mAb的特异性进行鉴定。结果:得到筛选出3株能稳定分泌抗TRX-1的杂交瘤细胞株B6、D5和E3,免疫球蛋白亚类均为IgG1(κ),腹水mAb效价均在106以上,3株抗体分别针对不同抗原表位。用mAb建立的竞争抑制ELISA灵敏度达1.22μg/L。结论:获得3株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗TRX-1的杂交瘤细胞株,为研究TRX-1在人类细胞、血液、组织中的表达及定位提供了可能,并为探索相关炎症、癌症发病机制及新治疗方法提供了强有力的工具。

人硫氧还蛋白存在不同的选择性剪切形式

利用RT_PCR技术、基因克隆化和基因表达技术 ,首次在人胎肝细胞中发现了人硫氧还蛋白 (hTRX)的另外一种选择性剪切形式 (hTRXδ3) .经测序证实hTRXδ3缺失正常hTRX第 3外显子的 6 0bp ,无其他编码区域改变 ,其酶活性位点依然存在 .经大肠杆菌表达重组蛋白的活性分析 ,hTRXδ3依赖DTT催化胰岛素还原的活性明显低于完整的hTRX蛋白 .

人硫氧还蛋白-1基因克隆及其重组载体的构建与鉴定

目的克隆人硫氧还蛋白-1(human thioredoxin-1,hTrx1)基因,并构建含有该目的基因的重组载体。方法以人胃癌细胞系BCG823、MNK45的总RNA为模板,设计含有酶切位点的特异性引物,用逆转录PCR的方法,扩增hTrx1编码蛋白的cDNA片段,连接至EZ-T载体,形成EZ-T-hTrx1。对EZ-T-hTrx1进行双酶切后将目的片段连接至pcDNA3.1myc-His,形成pcDNA3.1myc-His-hTrx1,并进行双酶切、测序鉴定。结果双酶切鉴定显示hTrx1cDNA成功连入pcDNA3.1myc-His质粒;测序结果显示目的片段连入质粒,且与GenBank(NM003329)完全一致。该实验成功构建出含hTrx1的重组载体pcDNA3.1myc-His-hTrx1。结论 hTrx1基因的克隆以及重组载体pcDNA3.1myc-His-hTrx1的成功构建,为进一步探讨hTrx1的生物学活性及其对肿瘤发生的作用机制奠定了基础。

人硫氧还蛋白1在大肠杆菌中的重组表达及其对高糖导致的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

目的克隆人硫氧还蛋白1(h TRX1)基因并构建其原核表达载体,获得重组人硫氧还蛋白1(rh TRX1),评价rh TRX1对高糖导致的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用。方法采用逆转录PCR方法扩增h TRX1基因片段,插入p ET22b(+)质粒并转化大肠杆菌Rosetta-gami(2),获得工程菌Rosetta-gami(2)-p ET22ab(+)/h TRX1。用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定重组蛋白的正确性,用镍亲和层析纯化重组蛋白。采用高糖制备HUVEC损伤模型,MTT比色法检测HUVEC的存活率,生化方法测定HUVEC中乳酸脱氢酶(LDH)的外漏率以及细胞上清液中一氧化氮(NO)的水平。结果构建的工程菌及其产生的重组蛋白rh TRX1正确。与正常对照组比较,高糖损伤组HUVEC的存活率降低、LDH外漏率明显升高,NO的水平明显地降低。不同剂量rh TRX1处理组HUVEC的存活率升高、LDH的外漏率明显降低,NO的水平明显地升高。结论成功克隆并在大肠杆菌中表达rh TRX1、获得结构正确的rh TRX1,rh TRX1对高糖诱导的HUVEC损伤具有保护作用。

人硫氧还蛋白1多克隆抗体制备及对内毒素血症新生大鼠的保护作用

目的克隆人硫氧还蛋白1(hTrx-1)基因并在大肠杆菌表达体系中进行有效表达,制备其多克隆抗体。初步探讨hTrx-1对内毒素血症新生Sprague-Dawley(SD)大鼠的保护作用。方法从人胎肝细胞中用RT-PCR的方法得到了hTrx-1全长基因,将它克隆到原核表达载体上,在大肠杆菌诱导表达并纯化,纯化的蛋白免疫SD大鼠,制备多克隆抗体。将新生SD大鼠分为正常组、脂多糖(LPS)组和hTrx-1组(n=12)。正常组、LPS组分别予以腹腔注射生理盐水、LPS(5 mg/kg);hTrx-1组于LPS注射前30 min腹腔注射hTrx-1(10 mg/kg)。观察正常组、LPS组与hTrx-1组新生大鼠24 h死亡率。结果成功构建PET-28a-hTrx-1原核表达载体,表达纯化了hTrx-1,获得高效价多克隆抗体。正常组、LPS组与hTrx-1组大鼠24 h的死亡率分别是0、67%、17%(χ2=14.400,P<0.01)。结论成功制备了hTrx-1多克隆抗体;初步证明了该蛋白对内毒素血症新生SD大鼠具有保护作用。

无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及活性检测

目的:利用基因工程的方法原核表达无标签的重组人硫氧还蛋白(rhTrx)并对其进行大规模表达、纯化和鉴定。方法:从人胚胎肾HEK293细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经两步离子交换层析纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE、Western blotting、HPLC、MALDI-TOF-MS及经典的胰岛素二硫键还原法对重组蛋白进行鉴定。结果:构建成功了rhTrx基因表达载体;实现了rhTrx在原核细胞中的可溶性表达;纯化出的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析证实为rhTrx;HPLC和MALDI-TOF-MS分析表明,纯化出的目的蛋白纯度大于95%;胰岛素二硫键还原法证实纯化出的rhTrx具有生物学活性。结论:成功构建了rhTrx的原核表达体系,建立了rhTrx的纯化和鉴定方法,为其进一步的理论研究和生产开发提供了有效基础数据。

重组人硫氧还蛋白工程菌生物学特性稳定性的检测

【目的】观察和检测重组人硫氧还蛋白工程菌BL21/pET-22b(+)-rhTrx生物学特性的稳定性。【方法】工程菌连续传代50代,通过对每10代进行质粒性状、蛋白表达水平、透射电镜观察、革兰氏染色及各项生化检查,全面检测工程菌可能影响生产性能的生物学特性稳定性。【结果】各代工程菌提取的质粒经双酶切后均可见315 bp的目的基因片段;各代工程菌中Trx蛋白的表达量均为菌体总蛋白的20%左右;透射电镜观察呈现典型的大肠杆菌特性;革兰染色显示为阴性杆菌;各项生化检测结果与原始菌种无显著差异。【结论】该菌种生物学特性稳定,可作为生产用菌种。