氨基端PLCε基因的克隆、原核表达及抗血清的制备

目的通过在原核系统中表达人磷脂酶Cε(phospholipase Cε,PLCε)基因,制备兔抗PLCε的抗血清,并验证其特异性。方法应用RT-PCR从人膀胱癌细胞的cDNA中克隆出部分PLCε基因,构建重组表达载体PGEX-6P-1/PLCε,并转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达GST-PLCε融合蛋白,通过GST亲和层析系统纯化重组蛋白,超滤后免疫家兔,获得家兔抗PLCε的抗血清。采用ELISA检测抗血清效价,Western blot测定其特异性。结果 RT-PCR扩增出336 bp的PLCε基因,并成功构建重组质粒PGEX-6P-1/PLCε,质粒测序结果显示,目的基因序列与GenBank中PLCε基因序列完全一致。将纯化后的GST-PLCε蛋白免疫家兔,获得抗血清;ELISA效价1∶16 000以上;Western blot结果显示,该抗血清与原核表达的GST-PLCε融合蛋白和人膀胱癌T24细胞株表达的PLCε蛋白特异性结合。结论在原核细胞中表达了PLCε蛋白,制备了家兔抗人PLCε的抗血清,可用于相关肿瘤检测,为进一步研究PLCε蛋白功能和作用机制奠定了基础。