人神经干细胞临床移植治疗帕金森病

目的 :探索人神经干细胞移植治疗帕金森病 (Parkinsondisease,PD)的有效方法。 方法 :5～ 1 1周人胚胎的前脑细胞在体外稳定扩增 ,并向多巴胺神经元转化 ,通过立体定向手术将其植入PD患者的纹状体 ;2 0 0 0年 1 1月至 2 0 0 2年 1 1月 ,采用此方法治疗 5 0例PD患者。 结果 :人胚胎前脑细胞可在体外扩增并维持不分化状态 1年以上 ,扩增的细胞可达原始细胞数量的 1× 1 0 7倍 ,并可向多巴胺能神经元转化 ;PD患者临床移植手术后随访 8～ 30个月 (平均 2 4个月 ) ,有效率为 92 % ,未见明显的免疫排斥反应。 结论

海马中56 kD蛋白诱导人神经干细胞向神经元分化的作用

在已证明切割海马伞海马中差异表达的56kD蛋白具有诱导神经干细胞迁移作用的基础上,进一步探讨其诱导神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化的作用。取切割SD大鼠海马伞后14d及正常海马组织的匀浆进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)。将用无血清培养技术获取的人胚神经干细胞球分别与切割海马伞后14d和正常海马56kD差异蛋白的胶条及空白对照胶条共培养,在倒置显微镜下观察神经干细胞球中细胞的迁移和分化情况,于第21d分别应用MAP-2免疫荧光和AChE组织化学方法检测人神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的情况,并进行神经元的计数、细胞面积、细胞周长的图像处理和统计学分析。结果显示,分化的MAP-2阳性神经元的数量、细胞面积及细胞周长三项指标切割组最好,正常组次之,而空白对照组最差;三组AChE组织化学染色均为阴性结果。上述结果提示切割海马伞后海马中差异表达的56kD蛋白具有诱导神经干细胞向MAP-2阳性神经元分化的作用,但不能诱导神经干细胞向AChE阳性神经元分化。

海马中56kD蛋白诱导人神经干细胞迁移的作用

为了探讨切割海马伞后的海马和正常海马在蛋白表达方面的差异,获取海马中具有生物活性的特异蛋白,并观察其对人胚神经干细胞迁移的影响,取切割SD大鼠海马伞后10、14、20d及正常海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NativePAGE)。将用无血清培养技术获取的人胚神经干细胞球分别与切割海马伞后14d海马和正常海马的56kD差异蛋白胶条及空白对照胶条共培养,观察神经干细胞球中神经干细胞迁移情况,第3d时计数朝胶条方向1/4扇区内的迁出细胞数。结果显示,切割后各天组和正常组比较见多条差异蛋白条带,其中56kD差异蛋白的密度积分正常组最低,10d组和20d组较高,14d组最高。神经干细胞球中向56kD差异蛋白胶条方向迁移的细胞数在切割组最多,正常组次之,对照组最少。提示切割海马伞后的海马与正常海马间存在多种差异蛋白,其中56kD蛋白在切割海马伞后14d表达量最高,并具有诱导神经干细胞迁移的作用。

白介素-1α及与白介素-11、白血病抑制因子和胶质细胞源性神经生长因子联合诱导人神经干细胞向多巴胺神经元的分化

目的探讨细胞因子白介素-1α(IL-1α)及与白介素-11(IL-11)、白血病抑制因子(LIF)和胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)联合应用对体外诱导人神经干细胞定向分化为多巴胺神经元的影响。方法采用无血清培养技术和单细胞克隆技术、免疫荧光双标技术。结果对照组仅有极少量的神经干细胞分化为不成熟的多巴胺神经元;IL-1α组分化的多巴胺神经元较多,但细胞形态欠成熟;联合因子组分化的多巴胺神经元最多,细胞较为成熟。结论IL-1α具有诱导人神经干细胞向多巴胺神经元分化的作用,联合应用IL-1α、IL-11、LIF和GDNF对人神经干细胞向成熟的多巴胺神经元分化具有协同作用。

NOV对人神经干细胞增殖和分化的影响

目的 探讨NOV蛋白对人神经干细胞 (HNSCs)增殖和分化的影响。 方法 NOV基因重组质粒转染COS 7细胞 ,收集COS 7细胞和NOV基因修饰COS 7细胞的条件培养液 (COS CM和NOV CM ) ,作用于培养的HNSCs,3H TdR掺入液闪检测HNSCs的增殖 ,免疫细胞化学和流式细胞仪检测HNSCs的分化。 结果 (1)NOV CM能明显促进HNSCs对3H TdR的摄入 ,说明NOV CM能明显促进HNSCs的增殖 ,另外NOV CM的促细胞增殖作用具有一定的量效关系 ;(2 )免疫细胞化学和流式细胞仪结果显示 ,NOV CM促进HNSCs向神经元方向分化。结论 NOV蛋白可能具有促进HNSCs增殖和分化的作用。

分离培养不同胚龄人神经干细胞的方法比较

目的:探讨不同胚龄人神经干细胞分离和培养的最适条件,为神经干细胞的基础及应用研究打下基础。 方法:采用无血清培养和单细胞克隆技术,从胚龄10周和20周人脑海马组织中分离和培养神经干细胞,并应用免疫细胞化学染色予以鉴定。 结果:从两个不同胚龄的人脑海马组织中均分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,未包被组10周龄的人胚脑海马组织在高密度悬浮培养法时神经干细胞生长不良,在其他密度及培养法均有神经干细胞克隆球形成;20周的人胚脑海马组织仅在中等密度悬浮培养法及 高密度贴壁培养法中有克隆球形成;包被组两种胚龄海马组织在各种密度培养法神经干细胞均生长不良。 结论:人胚脑海马组织中存在具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,且胚龄越大,培养难度越大;高密度贴壁培养法适宜各胚龄神经干细胞的分离培养。

人神经干细胞的体外生物学特性

本实验利用有丝分裂因子,体外诱导生成人神 经干细胞(NSCs),观察其生长特性并进行鉴定。取胎龄10-22周的大脑半球,分散细胞后种于添加表皮生长因子(EGF,20ng/ml)和/或碱性成纤维生长因子(bFGF,20ng/ml)的培养基中。利用免疫组织化学方法鉴定分化后的细胞类型。同时,进行细胞克隆分析、传代培养及端粒酶活性检测。结果显示:NSCs呈悬浮生长的干细胞球,其特异性抗原nestin阳性。NSCs具有增殖能力,可连续传代而不丢失其增殖和多分化潜能的干细胞特性。撤除EGF和bFGF的作用,细胞停止分裂,并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。克隆分析显示NSCs生长呈密度依赖性。人NSCs表达较低的端粒酶水平,并随培养时间延长而下调。研究表明,利用有丝分裂因子,可在体外成功诱导生成人NSCs,其生长,分化受内外源因素的调节,相关的机制还有待阐明。

人神经干细胞的研究现状及应用前景

人神经干细胞 (HNSCs)可从胚胎和成年人中枢神经系统 (CNS)成功分离并培养 ,具有自我更新和多分化潜能 ,经体外诱导或植入体内后均能分化为成熟神经元和神经胶质细胞 ,为多种CNS疾病特别是神经变性病的功能重建和神经再生提供了新的途径。本文就HNSCs的来源、分布、增殖和分化的调控因素以及治疗CNS疾病的应用前景作一综述。

MPTP诱导人神经干细胞衰老模型的建立

目的:建立MPTP诱导的人神经干细胞(hN SCs)衰老模型,探讨其衰老的相关生物学特点,从而为人神经干细胞衰老的研究提供细胞模型工具。方法:人胚胎干细胞系(H9)经体外诱导分化得到hN SCs,将第3代细胞接种到培养皿。在完全培养基基础上加入终浓度400μmol/L的MPTP处理24 h,处理结束后通过CCK8和Ki67染色、β-半乳糖苷酶染色、活性氧水平检测验证神经干细胞衰老模型的建立,应用Western Blot法检测相关基因SOD2,p21和p53的表达变化。结果:400μmol/L MPTP作用24 h后,hN SCs提前衰老,表现为CCK8光密度值显著下降,ki67阳性细胞比例显著下降,β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比显著升高,细胞活性氧水平显著升高。进一步在分子水平上表现为SOD2蛋白表达水平明显下降,p21,p53蛋白表达水平显著升高。结论:本研究证实400μmol/L MPTP作用24 h可建立人神经干细胞体外衰老模型,该模型的生物学变化可能是由SOD2,p21,p53的表达水平引起的。

人神经干细胞在脊髓损伤修复中的应用前景

人神经干细胞能从胚胎、成人的多种组织中获得 ,能在体外长期增殖并保持分化潜能。人神经干细胞在脊髓损伤康复中具有广阔的应用前景 。

人神经干细胞微囊泡对谷氨酸诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的:探究人神经干细胞微囊泡(human neural stem cell microvesicles,hNSC-MVs)对谷氨酸诱导PC12细胞损伤的作用及可能机制。方法:采用谷氨酸处理大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞,建立兴奋性损伤模型;实验分为3组:对照组,PC12细胞未经任何处理;谷氨酸组,谷氨酸处理PC12细胞24 h;hNSC-MVs+谷氨酸组,200 mg/L hNSC-MVs预处理PC12细胞24 h,再加入谷氨酸处理24 h。MTT法检测各组PC12细胞存活率;免疫印迹实验检测细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达。结果:PC12细胞能内化hNSC-MVs。谷氨酸对PC12细胞具有毒性作用,其半数抑制浓度为25 mmol/L。与谷氨酸组相比,hNSC-MVs+谷氨酸组PC12细胞存活率明显增高(P<0.01)。与对照组相比,谷氨酸组Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低,而与谷氨酸组相比,hNSC-MVs+谷氨酸组Bax蛋白表达明显下调,Bcl-2蛋白表达明显上调(P均<0.01)。结论:hNSC-MVs可能通过抑制谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡,从而发挥保护作用。

人神经干细胞的研究进展及应用前景

人神经干细胞具有自我更新和多分化潜能,可从人胚胎和中枢神经系统成功分离并培养,经体外诱导或植入体内后均能分化为成熟神经元和神经胶质细胞,为多种中枢神经系统疾病的功能重建和神经再生提供了新的途径。人神经干细胞是近年来的研究热点,但其生物学性状和分化调控机制尚不完全明了,现就神经干细胞的特性、表现、分化、迁移、临床应用及存在的问题等进行综述。

人神经干细胞研究为致命脑部疾病治疗带来新希望

据2012年10月11日Uchida N[Sci Transl Med,2012,4（155）：155ra136]报道,俄勒冈健康科学大学及Doernbecher儿童医院的医生证明,人神经干细胞HuCNS-SCs（StemCells公司的专利产品）能在患有严重髓鞘缺失症状的小鼠中生存并产生功能性髓鞘。髓鞘是神经膜细胞的质膜沿着轴索的轴心螺旋缠绕形成的多层脂双层结构。主要成分为髓磷脂,具有高度绝缘性。

新生鼠缺氧缺血性脑损伤后经脑室人神经干细胞移植的实验研究

目的研究新生鼠缺氧缺血性脑损伤后经脑室移植人胚胎脑神经干细胞后,植入细胞的存活、迁移及分化情况。方法孕12周人胚胎神经干细胞在含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子和白血病细胞抑制因子的N2培养基(D/F12+N2+B27)中培养11天。生后7天的新生SD大鼠32只建立缺氧缺血性脑病模型,3天后将培养的人神经干细胞制成悬液(1.0×105/μl),采用立体定向移植至实验动物损伤侧脑室。移植后1、2、4周及3个月(每时间点各8只)取脑组织行HE染色和免疫组织化学分析。结果移植后1周大量抗人细胞核蛋白抗体阳性的植入细胞从脑室沿胼胝体向外迁移并到达损伤区,以损伤侧皮层、海马多见,在不同区域可见与宿主细胞类似的分化的植入细胞:移行至皮层的植入细胞85%分化为抗人细胞核蛋白神经丝蛋白或抗人核蛋白神经元管蛋白抗体双阳性的皮层细胞,而位于移行区域的植入细胞60%表达为抗人核蛋白胶质纤维酸性蛋白抗体双阳性的星形胶质细胞,其余细胞仍在迁移中未分化。移植后2周更多的移植细胞到达损伤区,移植后4周及3个月植入细胞数较前明显减少。结论人胚胎神经干细胞经脑室移植至缺氧缺血性脑损伤的鼠脑后能存活、迁移,并依迁移区域的不同分化为神经元和星形胶质细胞。

人神经干细胞移植治疗重度新生儿缺氧缺血性脑病一例

目的探讨人神经干细胞移植方法治疗重度新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的可行性。方法一例出生75天的重度HIE后遗症患儿,智力运动发育严重滞后,肌张力异常,磁共振图像显示脑实质多发软化灶和萎缩。取孕11周人胚胎前脑细胞,经体外培养扩增为人神经干细胞(neuralstemcells,NSCS),并经患儿脑室穿刺注入。结果移植28天后患儿不仅肌张力显著改善,智力运动发育迅速追赶、接近正常同龄水平。PET显示顶颞叶放射性增加,细胞代谢明显增强,提示植入的细胞存活。结论本例人胚胎来源NSCS移植治疗重度新生儿HIE后遗症,近期临床疗效显著,远期疗效有待进一步观察。

基因芯片技术筛选人参皂苷Rg_1促进人神经干细胞增殖的分子靶点研究

目的:采用基因芯片技术筛选出人参皂苷Rg1促进人神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的主要分子靶点。方法:首先通过MTT法筛选出Rg1促进NSCs增殖的最佳作用质量浓度为120 mg·L-1。然后通过基因芯片技术,观察Rg1促其增殖7 d时靶基因表达,通过数据演算筛选出Rg1促进NSCs增殖的最主要的靶基因和信号转导途径。结果:在Rg1促进NSCs增殖第7天时,获得差异基因440个,其中显著上调的基因266个,显著下调的基因174个;HES1基因和CAMP(环磷酸腺苷)-PKA(蛋白激酶A),PI3K(磷脂酰肌醇-3激酶)-AKT信号传导通路与Rg1促进人NSCs增殖密切相关。结论:基因芯片筛选出的差异表达基因可能为研究Rg1促进NSCs增殖的分子机制研究提供线索。

人参皂苷Rg1对人神经干细胞功能表达的膜片钳研究

目的:观察人参皂苷Rg1诱导人神经干细胞(neural stem cells of human,hNSCs)的功能表达。方法:采用全细胞膜片钳技术分析人参皂苷Rg1诱导hNSCs分化7 d时,神经元样细胞的膜电生理特性以及钠、钾离子通道的功能表达。结果:人参皂苷Rg1(20 mg·L-1)诱导hNSCs分化7 d时,神经元样细胞的膜静息电位为(-45.70±2.63)mV,膜电容为(26.89±1.91)pF,膜输入阻抗为(877.51±20.44)MΩ(与对照组相比均P<0.05);电压依赖性的快速激活、快速失活的内向Na+电流,检出率50%,平均峰值为(711.48±158.03)pA(与对照组相比P<0.05);外向K+电流的主要成分是快速激活快速失活的瞬时外向K+电流和延迟整流外向K+电流,其平均峰值为(1 070.42±177.18)pA(与对照组相比P<0.05)。结论:人参皂苷Rg1可以促进hNSCs功能表达和成熟。

构建芯片技术探讨人参皂苷Rg_1促进人神经干细胞分化的机制

目的:采用基因芯片技术筛选出人参皂苷Rg1促进NSCs分化的主要分子靶点。方法:通过基因芯片技术,观察Rg1诱导人神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元分化7 d时靶基因表达,通过数据演算筛选出Rg1促进NSCs分化的最主要的靶基因和信号转导途径,然后采用Western blot和免疫组化的方法对其中的ERK信号分子进行验证。结果:在Rg1诱导NSCs分化第7天时,获得差异基因675个,其中显著上调的基因255个,显著下调的基因420个;MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)通路中的ERK1/2(细胞外信号调节蛋白激酶)信号分子与NSCs分化直接相关。经Western blot和免疫组化证实,在Rg1诱导NSCs分化中,ERK1/2蛋白明显上调,磷酸化水平也明显增强,此作用能够被PD98059(ERK1/2阻断剂)所阻断,同时PD98059也可以明显阻断NSCs的分化。结论:ERK1/2是人参皂苷Rg1促进NSCs分化的重要分子靶点。基因芯片筛选出的差异表达基因可能为研究Rg1促进NSCs分化的分子机制提供线索。