人神经生长因子β亚基cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :从海马组织提取中国人神经生长因子基因 (NGFβ) ,分析中国人NGFβ序列 ,再克隆成熟肽部分 ,使NGFβ在大肠杆菌中表达。 方法 :提取组织总RNA进行逆转录 ,克隆到PCRⅡ载体 ,得 6 5 0bpDNA片段 ,以PCRⅡ /NGFβ载体为模板 ,扩增C端成熟肽部分 ,并克隆到PG5中 ,转化大肠杆菌BL2 1用异丙基 - β -D -半乳糖苷(IPTG)诱导培养。表达产物提纯、复性后 ,进行活性测定。结果 :NGFβcDNA全序列为 10 4 7bp ,所克隆的蛋白编码部分为 6 36bp ,由 2 12个氨基酸组成 ,序列分析结果与Genebank完全一致 ,成熟肽部分表达后 ,经SDS -PAGE电泳在 14kD左右有 1条明显的新增蛋白带 ,与预期的分子量相符 ,并Western印迹证实 ,rNGF约占菌体蛋白 10 %左右。结论 :通过序列分析证实 ,重组NGFβ在大肠杆菌中获得较高水平的表达 。

重组人神经生长因子β腺病毒的构建及鉴定

[目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取人胎肝总RNA,应用RT-PCR方法以自行设计的带有His标签的引物来扩增NGF"β基因;将所扩增的NGF"β基因经酶切、纯化,与IRES-EGFP片段共同插入到Pshuttle-cmv载体中,测序后,利用基因同源重组技术构建hNGF基因的复制缺陷型腺病毒载体AdNGF"β,经鉴定,转染HEK293细胞,观察EGFP表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。[结果]克隆的hNGF基因序列与GenBank中的hNGF基因序列完全一致并在3′端携带上His标签;重组腺病毒载体AdNGF-β经PacⅠ酶切得到大于23.0和4.5或2.9kb大小的2个片段,表明同源重组成功。2种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞后,均可观察到绿色荧光蛋白。收获病毒并测定感染滴度分别为1.00×109和0.99×109pfu/ml。[结论]克隆了带有His标签的hNGF"β基因,并成功构建了重组腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤研究奠定基础。

重组人神经生长因子β基因腺病毒的构建与鉴定

目的构建表达人神经生长因子β基因片段的重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β。方法以健康人白细胞中DNA为模板,扩增h NGF-β基因片段,导入p GEM-T-Easy质粒,获得重组质粒p GEM-T/h NGF-β。经酶切鉴定后与复制缺陷型腺病毒穿梭质粒p ACCMV-p Lp A构建重组腺病毒穿梭质粒p ACCMV-h NGF-β。酶切鉴定后再与辅助包装质粒PJM17共转染293细胞,经同源重组后,构建复制缺陷型重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β。对Ad CMV-h NGF-β进行基因鉴定,并测定滴度及在He La细胞中的表达。结果顺利克隆出h NGF-β基因片段,构建的重组质粒p GEM-T/h NGF-β和重组腺病毒穿梭质粒p ACCMVh NGF-β,经酶切鉴定实际结果与理论推导符合。构建的复制缺陷型重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β滴度为1.2×1012pfu/ml,并能在He La细胞中表达。结论以h NGF-β基因片段为基础成功构建了重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β,测试表明该重组病毒具有高滴度活性和良好的感染人类细胞、表达目的蛋白的能力。

人神经生长因子β亚基cDNA的克隆及序列分析

目的：对国人神经生长因子β亚基（βＮＧＦ）ｃＤＮＡ 进行克隆及序列分析，为研究βＮＧＦ 的生理功能及其在临床应用提供基础与手段。方法：从人海马组织分离，纯化总ＲＮＡ，直接进行逆转录，用ＰＣＲ 扩增βＮＧＦ 的ｃＤＮＡ 得到６５０ｂｐ 的ＤＮＡ 片段，利用Ｔ－ Ａ 克隆载体法，制备重组质粒，克隆βＮＧＦｃＤＮＡ。结果：βＮＧＦ 的ｃＤＮＡ 全序列１０７４ ｂｐ ，其蛋白编码为６３０ ｂｐ ，由２１２ 个氨基酸组成，Ｎ 端为信号肽，中间区为前肽，Ｃ 端为成熟肽。结论：国人βＮＧＦ 序列分析结果与ｇｅｎｅ ｂａｎｋ 中的βＮＧＦ 序列完全一致。

重组人神经生长因子通过抑制小胶质细胞炎症反应发挥神经保护作用

目的探讨重组人神经生长因子(rhNGF)的神经保护作用及其机制。方法BV2小胶质细胞分为细胞对照组、脂多糖(LPS)组及LPS+rhNGF 50和500μg·L^(-1)组。除细胞对照组外,其余3组用LPS 1 mg·L^(-1)刺激BV2细胞24 h诱导BV2细胞炎症反应,随后LPS+rhNGF组加rhNGF继续孵育48 h。孵育结束后收集BV2细胞,并收集各组培养上清即条件培养基(MCM),各组BV2细胞和MCM分别与小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a(N2a)共培养12或24 h。CCK-8法检测BV2细胞存活率,实时荧光定量PCR检测BV2细胞中促炎因子白细胞介素(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-1β及抗炎因子IL-4和IL-10 mRNA表达水平,CBA法检测BV2细胞培养上清中IL-6,TNF-α,IL-4和IL-10浓度,免疫荧光法检测BV2细胞M1表型标志物CD16和M2表型标志物CD206表达,NeuN/TUNEL共染法和AnnexinⅤ/7-AAD法检测N2a细胞凋亡率。结果与细胞对照组相比,LPS组BV2细胞存活率显著下降(P<0.01),细胞变圆且胞体变大;促炎因子IL-1β,IL-6和TNF-α及抗炎因子IL-10 mRNA水平显著升高(P<0.01),抗炎因子IL-4 mRNA水平下降(P<0.01);IL-6和TNF-α蛋白水平显著升高(P<0.01),IL-4蛋白水平无显著差异;CD16和CD206阳性细胞百分比明显升高(P<0.01),CD16阳性细胞升高更加明显;与BV2细胞或其MCM共培养的N2a细胞存活率显著降低且凋亡率显著升高(P<0.05,P<0.01)。与LPS组相比,LPS+rhNGF 50和500μg·L^(-1)组BV2细胞存活率显著提高(P<0.01);IL-1β,IL-6和TNF-αmRNA水平显著降低(P<0.05),IL-4和IL-10 mRNA水平显著提高(P<0.05,P<0.01);IL-6和TNF-α蛋白水平显著降低(P<0.05,P<0.01),IL-4蛋白水平无显著差异,IL-10浓度低于检测限;CD206阳性细胞百分比显著升高(P<0.01),CD16阳性细胞百分比显著降低(P<0.05)。与LPS处理的BV2细胞或MCM-LPS组相比,与rhNGF 50和500μg·L^(-1)处理的BV2细胞共培养组及与MCM-rhNGF 50和500μg·L^(-1)共培养组N2a细胞存活率显著升高且凋亡率显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论rhNGF可通过抑制BV2细胞炎症反应诱导BV2细胞向M2表型转化,抑制N2a细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。

人神经生长因子的基因克隆和序列分析

目的 克隆人神经生长因子基因编码区。方法 由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA ,利用PCR法 ,从DNA中扩增出人神经生长因子编码区基因DNA片段 ;将获得的基因片段插入 pGEM T Easy质粒中 ,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果 经质粒DNA酶切分析及序列测定 ,获得了人神经生长因子DNA片段序列。结论 首次由人白细胞DNA中克隆获得了人神经生长因子基因 ,为神经生长因子的基因治疗提供了前提条件。

人神经生长因子治疗坐骨神经干性损伤的疗效观察

为了寻找周围神经损伤后更为理想的疗法，采用人神经生长因子（ＮＧＦ）治疗坐骨神经干性损伤４７例，有效率９４％，康复治疗为主的对照组３０例，有效率６０％。２组治愈率相比具有极显著差异（Ｐ＜０．００５），提示人ＮＧＦ组疗效优于对照组。人ＮＧＦ的疗效以及运动神经传导速度改善与早期使用和神经损伤程度密切相关。

人神经生长因子治疗糖尿病性多发性神经病的疗效和安全性

目的:考察人神经生长因子(hNGF)对糖尿病性多发性神经病(DPN)的疗效和安全性。方法:采用随机双盲对照研究,60例DPN患者分hNGF治疗组30例,给予hNGF 4mL·d-1(1 000U)肌内注射,对照组30例给予安慰剂4mL肌内注射,2组疗程均为12周。主要观察指标为神经体征(密西根糖尿病神经评分,MDNS),辅助观察指标为神经症状(自觉感觉异常)和神经传导速度(NCV)。结果:治疗84d后2组中度和重度患者的MDNS评分显效率比较差异均有显著性(P<0.05),治疗后84d和168d,治疗组NCV异常率均显著低于对照组(44.00% vs72.67％,P<0.01;39.23 96 vs 62.86％,P<0.01)。治疗组疗效确切,未发现严重不良反应。结论:hNGF治疗DPN安全有效,其疗效和NCV的改善与hNGF治疗开始时间、疗程长短、DPN病变的程度密切相关。

碱处理法在人神经生长因子注射液制备中的应用

目的进一步提高人神经生长因子(hNGF)注射液的安全性,寻找碱处理灭活制品中可能存在脂包膜和非脂包膜病毒的最佳工艺。方法在hNGF注射液中间品中加入脂包膜和非脂包膜病毒,通过调整其pH值、蛋白质浓度等参数后,在25℃下的不同时间,监测其灭活病毒效果。结果在pH(12.0±0.1)、(25±1)℃条件下存放2h,可有效灭活加入的脂包膜和非脂包膜病毒,且其他相关指标也达到要求。结论碱处理法是同时灭活生物制品中脂包膜和非脂包膜病毒的1种经济、有效的方法。

真核细胞中人神经生长因子cDNA的表达

目的 构建人神经生长因子 c DNA的表达载体 pc DNA3.1- NGF,并在哺乳动物细胞中进行一过性表达 ,为以后人神经生长因子的基因治疗打下基础。方法 在本研究室已克隆人神经生长因子 c DNA的基础上 ,构建表达载体 pc DNA3.1- NGF。用 DEAE-葡聚糖转染技术将 pc DNA3.1- NGF导入 COS- 7细胞 ,将人神经生长因子c DNA进行一过性表达 ,并采用 Western blot方法检测表达情况 ,以鸡胚背根神经节的生长检测表达蛋白的生物活性。结果 成功构建了表达载体 pc DNA3.1- NGF,Western blot方法检测出 COS- 7细胞表达有目的蛋白 ,并具有一定的生物活性。结论 用哺乳动物细胞一过性表达了人神经生长因子 ,并具有一定的生物活性。

人神经生长因子成熟蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达和生物活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达人神经生长因子成熟蛋白基因片段(hNGFβ)并检测其生物活性.方法将NGFβ目的基因亚克隆人表达载体pBV220的BamHI-BamHI位点,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株通过热诱导表达NGFβ蛋白,利用溶解包涵体和重折叠使表达产物复性,将复性后的蛋白质加入体外培养的鸡胚背根神经节及PC12细胞BrdU掺入实验,观察表达蛋白的生物学活性.结果成功构建了重组质粒pBV220/NGFβ.使用该质粒转化DH5o宿主菌,使用热诱导方法表达了NGFβ蛋白,SDS-PAGE结果提示表达蛋白主要存在于包涵体中.通过肝素亲和层析可以获得纯度大于90%的NGFβ.每升表达菌可以获得1.8～2.0 mg NGFβ.鸡胚背根神经节突起生长实验和PC12细胞培养生长刺激BrdU掺入实验表明原核表达的NGFβ是具有生物活性的.它的生物活性按生物制品鉴定章程判断为1×105BU/g.结论在大肠杆菌中可以表达出有活性的NGFβ蛋白.

神经生长因子治疗糖尿病周围神经病的临床及电生理观察

目的:观察人神经生长因子(hNGF)对糖尿病性多发性神经病(DPN)的疗效及安全性。方法:对30例病人进行了治疗前后临床评价及正中神经、尺神经、腓总神经及腓肠神经运动、感觉传导速度和运动末端潜伏期测定。结果:hNGF可不同程度地减轻病人的肢体麻木、疼痛及发凉等临床症状;正中、尺、腓总神经传导速度也有明显的改善;治疗过程中未发现明显的不良反应。结论:人神经生长因子治疗糖尿病性多发性神经病是安全有效的。

人神经生长因子治疗血管性痴呆疗效观察

目的：探讨神经生长因子治疗血管性痴呆的疗效。方珐：明确诊断血管性痴呆患者47例，随机分为观察组和对照组，观察组24例应用神经生长因子治疗，对照组23例应用普通药物治疗，3疗程后观察结果。结果：观察组患者智力及认知能力均明显高于对照组，有效率达87．5％。结论：与其它治疗方法相比，应用神经生长因子治疗血管性痴呆有显著疗效。

人神经生长因子对DPN大鼠坐骨神经CGT的作用

目的 观察人神经生长因子 ( h NGF)对早期糖尿病多发性神经病 ( DPN)大鼠坐骨神经中半乳糖神经酰胺转移酶 m RNA( CGTm RNA)表达的影响。方法 用链脲佐菌素 ( STZ)一次性腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型 ,在 DPN 4周 (造模后 4周 )腹腔注射 h NGF( 90 U .kg- 1 .d- 1 ) ,共 4周。用 RT- PCR和免疫组化方法观察坐骨神经CGTm RNA,NGFm RNA和蛋白表达。结果 DPN 8周大鼠坐骨神经 CGTm RNA升高 ,NGFm RNA和蛋白表达减少。用 h NGF治疗的 DPN大鼠 CGTm RNA明显降低 ,NGFm RNA和蛋白表达增加。结论 h NGF治疗能纠正早期DPN大鼠坐骨神经 CGTm

重组人神经生长因子真核表达载体构建及其在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建了重组人神经生长因子(Recombinant human nerve growth factor,rhNGF)的一种真核表达载体,并转化毕赤酵母GS115.在h NGF基因序列基础上对其进行毕赤酵母偏好密码子分析与改造,然后构建重组质粒p PIC9K-h NGF,经PCR、酶切及测序验证后,转化酵母,利用遗传霉素筛选出高效表达rhNGF的重组酵母.表达产物经SDS-PAGE分析,结果见一条与h NGF分子质量15.7kDa相当的条带,蛋白表达量约为52.86%.将表达产物经初步纯化和进一步精提后,纯度超过98%.分别以鼠NGF产品和人NGF标准品为对照,利用TF-1细胞/MTS比色法检测NGF活性,结果表明rh NGF具有良好的生物学活性,其活性和比活性分别为5.0U/m L和253U/mg,高于鼠NGF产品(2.6 U/mL,130U/mg),与hNGF标准品相当(5.0 U/mL,250 U/mg).

人神经生长因子预防鼠脑损伤的研究

已有很多实验研究证实，应用从鼠颌下腺提取的神经生长因子能够预防鼠脑隔－海马通路横切后造成的神经元死亡。本文研究了从人胎盘中提取的神经生长因子预防鼠脑隔－海马通路横切后造成神经元死亡的作用。

人神经生长因子的原核高效表达

神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一,也是最早发现和最典型的神经营养因子。它影响外周和中枢神经系统某些神经元的存活与分化;NGF在神经损伤时可保护其效应神经元,促进神经纤维再生,增加脑移植中某些神经元的存活;它对外伤、中毒、老化等因素引起的脑疾患有治疗作用,并具有神经修复功能,尤其是对早老性痴呆症、帕金森氏病的治疗作用比较乐观。虽然NGF在神经损伤和神经退行性病变的诊断和治疗中有巨大的临床应用价值。

单抗体夹心ELISA定量检测人神经生长因子试剂盒的研制

目的制备抗人神经生长因子（h NGF）单克隆抗体,并开发一种检测h NGF含量的ELISA试剂盒。方法以重组人神经生长因子抗原与弗氏完全佐剂混合免疫BALB/c小鼠,并采用杂交瘤技术制备抗h NGF的单克隆抗体,然后建立快速检测h NGF含量的ELISA检测试剂盒。结果获得1株可分泌抗h NGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。建立1种检测h NGF含量的ELISA试剂盒,该检测方法的回收率为85%-105%,灵敏度为0.63 ng/ml,变异系数〈10%,且特异性良好。结论成功制备了抗h NGF的单克隆抗体,并建立了一种可快速检测h NGF含量的ELISA试剂盒。

重组人神经生长因子对糖尿病大鼠难愈创面愈合的影响

目的研究重组人神经生长因子(recombinant human nerve growth factor,rh NGF)对糖尿病大鼠合并难愈创面的治疗效果。方法腹腔注射链脲佐菌素(60 mg·kg^(-1))诱导大鼠糖尿病模型,并在大鼠背部造成一圆形烫伤创面,建立糖尿病合并难愈创面的动物模型。用药组rh NGF(3、6、12μg·kg^(-1))肌肉注射给药,每天1次,连续21 d。测定大鼠伤口面积,HE染色和透射电镜检查创面皮肤组织病理形态学变化。结果 rh NGF明显减小糖尿病大鼠烫伤创伤面积(P <0. 05); HE染色结果表明,rh NGF明显促进糖尿病大鼠烫伤创面纤维细胞和毛细血管再生;透射电镜结果表明,rh NGF对糖尿病大鼠烫伤创面皮肤的上皮细胞结构排列、细胞连接以及上皮下胶原等超微结构有明显改善作用。结论rh NGF对糖尿病大鼠烫伤性难愈创面具有促进愈合的作用。

人神经生长因子注射液人体药物安全观察

各种因素造成的神经系统损伤疾病的患者数目庞大,尤其随着人口老年化程度的升高,老年性痴呆症、糖尿病性周围神经病患者日益增多,对这类疾病的治疗目前尚无有效药物.大量体内外实验表明,神经生长因子(Nerve Growht Factor,NGF)对神经损伤及许多退行性神经系统的疾病有明显疗效.[1]我们以人胎盘为原料,建立了人神经生长因子(HuNGF)纯化制备工艺.[2]药效学试验证明本药对神经损伤有治疗作用.[3]已完成临床前试验并获准进入临床研究.