Mortalin通过PI3K/AKT通路对人神经胶质瘤细胞U87增殖迁移的影响

目的构建Mortalin慢病毒过表达载体和干扰载体,转染人神经胶质瘤细胞U87,探究Mortalin对U87细胞活力及增殖侵袭效应。方法经PCR技术扩增得到Mortalin过表达片段,引物退火得到Mortalin干扰片段,连接线性表达载体并转染293T细胞后,从293T细胞上清液中获取Mortalin慢病毒载体。通过转染剂(感染增强液)转染U87细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,qRT-PCR检测转染Mortalin慢病毒载体后在U87细胞中表达状况。CCK-8实验、克隆实验、划痕实验分别验证Mortalin对U87细胞活力、增殖、迁移的影响,Western blot验证PI3K/AKT蛋白表达。结果成功构建Mortalin慢病毒载体,转染人神经胶质瘤(U87)细胞。与Control组相比,NC组变化差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组相比,过表达Mortalin可以提高U87细胞集落形成和迁移能力(P均<0.05),PI3K/AKT蛋白高表达(P<0.05),而干扰组U87细胞则低表达(P<0.05)。结论Mortalin能够提高U87细胞活力,并通过激活PI3K/AKT信号通路促进细胞增殖、迁移。

硝酸镧对人神经胶质瘤SWO细胞的作用

采用体外培养技术,通过MTT比色法、光镜、扫描电镜和透射电镜等实验方法观察La(NO3)3对人神经胶质瘤SWO细胞的作用。结果表明浓度为0.1,0.5,1.0,1.5mmol·L-1的La(NO3)3均可抑制SWO细胞的增殖,并具有剂量依赖性,La(NO3)3作用后细胞收缩变圆,细胞膜上出现孔洞,核膜皱缩、异染色质凝集增多、细胞器破碎。La(NO3)3对SWO细胞具有抑制杀伤作用。

微波及γ射线单独或联合辐射对人神经胶质瘤细胞HSP70表达的影响

[目的]探讨微波及γ射线单独或联合照射对人神经胶质瘤细胞(SHG44细胞)热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。[方法]SHG44细胞按是否接受γ射线照射(5Gy)分为单独微波组(M组)和射线微波联合组(IM组);两组又均以接受微波强度不同(0、2、4、6mW/cm2)分为4个亚组,即M0、M2、M4、M6亚组和IM0、IM2、IM4、IM6亚组。用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞存活率,用western blot和RT-PCR方法检测HSP70的表达。[结果]与M0组相比,M4、M6、IM6组的细胞存活率均明显下降(P<0.05或P<0.01),尤以IM6组下降为甚;且IM6组的细胞存活率也低于单独γ射线照射组(IM0组),P<0.01。与M0组相比,各剂量M组的HSP70表达差异无统计学意义;经γ射线照射后,即各IM组的HSP70表达较M0组均明显下降(P<0.01);而与IM0组相比,各IM组的HSP70表达差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]本实验条件下,微波和γ射线单独或联合辐射均能降低细胞存活率;γ射线照射能抑制HSP70的表达,但微波不能引起HSP70表达的明显变化。

寨卡病毒感染人神经胶质瘤细胞所诱导的细胞因子表达水平的变化

目的研究寨卡病毒(ZIKV)感染人神经胶质瘤细胞(U251)所导致的细胞因子分泌的变化,探讨ZIKV影响神经系统功能紊乱的机制。方法建立ZIKV感染U251细胞模型,收获感染后第1、3、5、7天细胞培养上清液,采用悬浮芯片系统(Bio-Plex~? 200)Luminex多重检测技术同时定量检测细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α和IL-12P70的浓度。结果细胞因子IL-4的浓度水平低于检测范围(<0.001 pg/mL);病毒感染组分泌IL-5、IL-6、TNF-α和IL-12P70(169.9±12.1、7 747.9±949.2、29.0±0.5和93.3±2.0 pg/mL)的浓度水平均高于对照组(分别为124.6±8.6、2 652.2±386.0、25.5±0.8和85.4±1.8 pg/mL),且随着病毒感染时间的增加而分泌增加;在所有检测的细胞因子中,最显著表达的细胞因子是IL-6。结论 ZIKV感染U251细胞可分泌浓度水平相对较高的促炎性细胞因子,促炎细胞因子可能是影响神经发育的关键因素。

线粒体移植增强人神经胶质瘤U87细胞的辐射敏感性

线粒体移植(mitochondrial transplantation)是从患者正常组织分离线粒体然后注入线粒体损伤或缺失的部位,使损伤细胞获得救治、器官功能得以恢复的全新干预技术。本研究重点探讨线粒体移植对人神经胶质瘤细胞(U87)辐射敏感性的影响。提取人星形胶质细胞(human astrocytes,HA)的线粒体,用荧光探针Mito-Tracker Red进行标记后再与U87细胞共培养,激光共聚焦显微镜观察发现,Mito-Tracker Red的红色荧光大量出现在U87细胞内;随后对进入细胞内的游离线粒体荧光强度进行定量分析,游离线粒体和U87细胞共培养12 h时,单细胞内荧光强度由本底值0. 08上升至1. 83,表明游离线粒体可以通过共培养方式进入U87细胞内。随后给予U87细胞X射线辐照,Western印迹结果显示,联合组与单独辐照组相比,Cyto-C和Bax的表达量分别由179. 5%和198. 5%升高至251. 72%和256. 10%,Bcl-2的表达量由57. 17%降低至22. 23%;使用Annexin V/PI双染法检测到联合组U87细胞凋亡量相比单独辐照组的3. 1%和23. 5%上升至19. 2%和43. 8%; RT-CES检测结果表明,96 h内联合组U87细胞生长曲线被抑制;联合组克隆形成率相对单独辐照组的53%下降至29. 3%。鬼笔环肽染色发现,线粒体移植组细胞表面丝状伪足相比对照组明显减少。本研究提示,线粒体移植能够促进辐射诱导的肿瘤细胞凋亡,对U87细胞具有辐射增敏作用,其作用机制与重新激活线粒体凋亡通路、降低肿瘤恶性程度有关。

短叶松素-3-乙酸酯对人神经胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨短叶松素-3-乙酸酯(Pinobanksin-3-acetate,PB3A)对人神经胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法体外培养人神经胶质瘤U251细胞,将细胞分为空白对照组(0μg·mL^-1)和PB3A组(2.5、5、10、20、40、80μg·mL^-1)。以倒置显微镜观察PB3A处理后细胞的形态变化;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;EDU实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率;Western Blot法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、CyclinB1及CyclinD1蛋白的表达。结果与空白对照组比较,PB3A在5~80μg·mL^-1范围内的细胞增殖抑制率均明显增高(P<0.05,P<0.01),且呈现出浓度和时间依赖性;PB3A 10、20、40μg·mL^-1组EDU阳性细胞率均明显降低(P<0.01),细胞凋亡率均明显升高(P<0.01),G0/G1期细胞比例均明显降低(P<0.05,P<0.01),G2/M期细胞比例均明显升高(P<0.05,P<0.01);PB3A 20、40μg·mL^-1组均能明显上调Bax、Caspase-3蛋白的表达(P<0.01),下调Bcl-2、CyclinB1蛋白的表达(P<0.01),对CyclinD1蛋白的表达均无明显影响。结论PB3A能抑制人神经胶质瘤U251细胞增殖,诱导细胞凋亡,并阻滞细胞周期于G2/M期,其机制可能与调控凋亡和周期相关蛋白的表达有关。

黄莲提取液对人神经胶质瘤细胞体外增殖的影响及其作用机制

目的探讨黄莲提取液对人神经胶质瘤细胞(C6)体外增殖的影响及其可能的作用机制。方法用10、20、40、60μl/ml的黄连提取液分别作用C6细胞48 h后,倒置显微镜下观察C6细胞形态;作用24、48、72 h后,MTT法检测黄莲提取液对C6细胞体外增殖的影响。用40μl/ml的黄连提取液分别作用C6细胞0、20、40及60 min后,Western blot法分析C6细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果倒置显微镜下观察可见,随着黄莲提取液浓度的升高,坏死细胞的数量逐渐增多;40μl/ml黄莲提取液作用48 h时的抑制率显著高于10及20μl/ml浓度组(P<0.05),与60μl/ml浓度组差异无统计学意义(P>0.05);C6细胞中Bax蛋白表达水平随黄莲提取液作用时间的延长而上升(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平随黄莲提取液作用时间的延长而下降(P<0.05)。结论黄莲提取液对C6细胞的增殖具有显著的抑制作用,且可能是通过Bcl-2途径实现的。

miRNA 520h影响神经胶质瘤发生的初步研究

目的:综合分析胶质瘤标本中基因的表达,体外生物学作用的检测及对临床病例预后的长期随访,评价胶质瘤中miR-520h的生物学作用及其与NF-κB通路的关系。方法:选取46例II到IV级胶质瘤标本,常规RT-PCR检测前体microRNA(pri-miR-520h)的表达,免疫组织化学方法评估Ki-67指数;对46例患者的预后进行KPS评分及肿瘤复发与相关死亡率监测;用520h抑制剂转染U251胶质瘤细胞后缺氧培养,Western blotting检测p-NF-κB/p65等蛋白的表达水平。结果:miR-520h的RT-PCR分析及免疫组织化学结果显示,表达前体miR-520h(Pri(+))的病例Ki-67阳性率较低,而表达成熟miR-520h的病例Ki-67阳性率增加;长期随访结果显示,Pri(+)病例的KPS评分比Pri(-)病例显著增高;此外,高表达前体miR-520h(Pri(+))的病例预后较好,肿瘤复发和相关死亡率较低,说明pri-miR-520h(+)病例预后较好;Western blotting显示浓度为200 nmol/L的has-miR-520h抑制剂在缺氧条件下,促进U251胶质瘤细胞中p-NF-κB/p65的表达。结论:miR-520h在胶质瘤的发生中具有重要的作用,成熟miR-520h作为原癌miR,能诱导胶质瘤细胞的发生。

热疗对增强阿霉素治疗神经胶质瘤敏感性研究

目的探讨热疗对提高人神经胶质瘤细胞U251阿霉素敏感性的影响及相关机制。方法将U251细胞分为空白对照组、化疗组、热疗组及热疗+化疗组分别进行相应处理。48h后采用台盼蓝拒染法检测细胞存活率,使用SRB检测肿瘤细胞抑制率,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞表面P-gp蛋白和Bcl-2蛋白的表达情况。以作用48h的IC 50值作为实验的工作浓度。结果化疗及热疗对U251细胞有明显抑制作用(P<0.01),热疗+化疗组与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.01);热疗组、化疗组及热疗+化疗组的细胞凋亡率均较对照组显著升高,各组比较差异均有统计学意义(P<0.01);p-gp蛋白及Bcl-2蛋白表达均下降,各组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论热疗联合阿霉素化疗能增强对U251细胞的体外抑制作用,提高肿瘤细胞的凋亡率,通过联合热疗有效下调P-gp及Bcl-2蛋白的表达,提高U251细胞对阿霉素化疗的敏感性。

哇巴因诱发人神经胶质瘤U251细胞凋亡的机制

【目的】研究哇巴因抑制人神经胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡的作用机制。【方法】通过MTT分析细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期,高内涵筛选和Western blotting法检测HIF-1α、Akt、m TOR等相关基因表达变化。【结果】MTT显示哇巴因抑制U251细胞24 h的IC50值为3.3μmol/L;流式细胞术显示哇巴因作用U251细胞出现S期阻滞;高内涵和Western blotting显示哇巴因通过下调神经胶质瘤细胞U251细胞中HIF-1α、Akt、m TOR和p-m TOR表达,同时上调p-Akt和Nrf2表达,抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。【结论】哇巴因可抑制人神经胶质瘤U251细胞增殖、诱导细胞凋亡,可能将成为一类新的化学治疗神经系统肿瘤的天然产物。

结合使用反义和疫苗技术治疗肿瘤

新的“免疫-基因疗法”使大鼠在被颅内移植了致死剂量的人神经胶质瘤细胞时免于死亡,且使鼠类保持免疫记忆,使其再接触肿瘤细胞时能抵抗肿瘤。 结合使用反义和肿瘤治疗疫苗技术是一项明智之举,NIH’s Recombinant DNA Advisory Committee(RAC)已获准进行人体实验。据其发明者Habib Fakhrai最近在UCLA全体人员会议上所述,它有希望获得FDA的最终批准。

肠道病毒71型对人神经胶质瘤U251细胞线粒体动力学的影响

目的探讨肠道病毒71型(EV71)对人神经胶质瘤U251细胞线粒体动力学的影响。方法采用非洲绿猴肾细胞Vero对EV71进行增殖,用Reed-Muench公式计算病毒液的50%细胞感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50);将EV71接种于U251细胞,光学显微镜下观察细胞形态,激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态,透射电镜观察线粒体超微结构的改变;Western blot检测线粒体分裂蛋白Drp1、p-Drp1(S637)和融合蛋白Opa1的表达水平;ATP试剂盒检测线粒体ATP水平;MitoSOX染色检测线粒体超氧化物水平。结果EV71的TCID50为10-5.4/0.1 mL;EV71感染U251细胞24 h、48 h后细胞明显出现皱缩、变圆或死亡。激光共聚焦显微镜和透射电镜结果显示,EV71感染后细胞线粒体明显延长,线粒体嵴模糊不清;Western bolt结果显示,EV71感染U251细胞24 h和48 h后,Drp1、Opa1表达降低,而p-Drp1(S637)在48 h表达升高,且差异有统计学意义(P<0.05)。EV71感染48 h后,与未感染EV71的U251细胞相比,线粒体ATP生成减少,线粒体超氧化物水平升高(P<0.05)。结论EV71感染U251细胞后,能引起线粒体形态及动力学改变,进而导致线粒体功能的变化,这可能是其引起神经系统功能紊乱的机制之一。