人端粒结合蛋白TRF1的克隆、表达和抗体制备

利用RT PCR技术 ,从HeLa细胞的cDNA文库中扩增到人端粒结合蛋白 1(hTRF1)基因编码区序列 ,克隆至pUCm T载体 ,测序正确后 ,构建带His6 tag原核表达载体pET 2 8c TRF1,经IPTG诱导表达的His6 TRF1融合蛋白分子量约为 6 5kD ,Western blot证实表达产物可特异地与TRF1抗体sc 6 16 5结合。用Ni2 + NTA胶亲和层析纯化可得到电泳均一的融合蛋白 ,免疫新西兰纯种大白兔 ,获得特异性好的多克隆抗体 ,该抗体可用于免疫荧光染色和Western blot方法检测哺乳动物细胞内源性的TRF1分子。

人端粒重复序列结合因子在急性白血病细胞中的表达及与端粒酶活性的关系

目的 :研究人端粒重复序列结合因子 (TRF1)在 30例急性白血病细胞中的表达 ,了解 TRF1表达与急性白血病分型的关系 ,以及与端粒酶活性的关系。方法 :用荧光定量 RT- PCR定量检测 30例急性白血病细胞中TRF1m RNA表达情况 ,同时检测 h TERT m RNA的表达 ,并分析两者之间的相关性。结果 :TRF1在急性非淋巴细胞性白血病 (ANLL)细胞中的表达 0 .0 12 6 (0 .0 12 7～ 0 .0 5 46 )明显低于正常人骨髓单个核细胞中的表达 0 .0 4 5 7(0 .0 0 839～ 0 .2 6 2 ) (P<0 .0 0 1) ,但在急性淋巴细胞性白血病 (ALL)细胞中的表达 0 .0 74 5 (1.92× 10 -6～ 0 .193)与正常人骨髓单个核细胞比较差异无显著性 ,且在 ANL L细胞中的表达明显低于 ALL细胞中的表达 (P=0 .0 0 1)。TRF1和 h TERT在急性白血病细胞和正常人骨髓单个核细胞中的表达无显著相关性 (r=- 0 .173,P=0 .2 0 7)。结论 :TRF1m RNA在 ANLL细胞中表达明显降低 ,而在 ALL细胞中表达无显著改变 ,提示 ANLL细胞中 TRF1可能通过调控端粒长度对端粒酶起间接负调控作用。

盐酸阿霉素与人端粒DNA相互作用的电化学研究

建立了石墨烯修饰玻碳电极上研究盐酸阿霉素（DOX）与人端粒DNA相互作用的电化学方法。实验发现,在p H 6.0 PBS缓冲溶液中,DOX在-0.585 V和-0.638 V处有1对氧化还原峰,氧化峰电流与DOX的浓度在0.03-0.8μmol/L和0.8-10μmol/L范围内分段呈良好的线性关系,检出限（S/N=3）为0.01μmol/L。对0.5μmol/L的DOX进行11次平行测定,相对标准偏差为3.5%。将不同浓度的人端粒DNA加入DOX,DOX的氧化峰电流明显降低,且紫外光谱有蓝移增色效应,表明二者发生了相互作用,结合比为1∶1,结合常数为1.11×10^3L/mol。

人端粒重复序列结合因子(hTRF1)蛋白质在急性白血病中的表达水平与端粒酶活性关系的研究

为了研究人端粒重复序列结合因子(TRF1)蛋白质在急性白血病(AL)及正常骨髓组织中的表达水平,AL和正常骨髓组织中端粒酶活性及TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性的关系,定量分析了AL患者及正常人骨髓组织中TRF1蛋白质的表达水平,并应用经倍比稀释的TRF133-277纯化蛋白质作为定量标准,建立以抗TRF133-277单克隆抗体的定量Westernblot的方法,而且以该方法检测TRF1蛋白质在组织中的表达水平;另外,应用TRAP-PCR-ELISA法检测AL患者及正常人骨髓组织端粒酶活性,以研究TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性的关系。结果表明:20例AL患者骨髓组织中TRF1表达水平较正常人骨髓组织显著降低,差异具有显著性(P<0.01);急性淋巴细胞性白血病患者的TRF1表达水平较急性非淋巴细胞性白血病患者略减低,但差异无统计学意义(P>0.05);化疗缓解的患者TRF1表达水平较前增高,但仍低于正常(P<0.01);化疗后完全缓解患者的TRF1表达水平较未缓解的患者显著增高,差异具有显著性(P<0.01);AL患者初发未治时骨髓细胞端粒酶的活性明显高于正常人(P<0.05)和首次缓解者(P<0.01);初发未治时,ALL患者骨髓细胞端粒酶活性略高于ANLL患者,但差异无统计学意义(P>0.05)。TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性呈明显负相关(P<0.001)。结论:TRF1蛋白质在AL患者骨髓细胞中的表达明显减低,且与疗效及端粒酶活性相关。

人端粒保护蛋白POT1和TRF2在喉癌中的表达

目的探讨人端粒保护蛋白1(human protection of telomeres1,POT1)和端粒重复序列结合因子2(telomeric repeat binding factor-2,TRF2)在喉鳞状细胞癌(简称喉癌)及声带息肉中的表达及意义。方法采用间接免疫荧光法检测20例喉癌、19例声带息肉中POT1和TRF2的表达水平。结果POT1和TRF2在喉癌中的阳性表达率为65.00%和70.00%,在声带息肉中未见POT1和TRF2的表达。POT1在低分化喉癌中的表达高于POT1在高及中分化喉癌中的表达(P<0.05),POT1的表达水平在喉癌的不同发生部位、T分级、临床分期及淋巴结转移率中的差异无统计学意义(P<0.05)。TRF2的表达程度与肿瘤的发生部位、组织病理、T分级、淋巴结转移率和临床分期均无关(P<0.05)。相关分析显示喉癌中POT1的表达与TRF2的表达无相关性(P<0.05)。结论POT1和TRF2在喉癌中高表达,两者在喉癌的发生中可能起重要作用。POT1在喉癌中的表达与肿瘤的分化程度有关。

人端粒保护蛋白在胃癌中的异常表达及其临床意义

目的探讨人端粒保护蛋白(humanprotectionoftelomeres,hPOT1)在胃癌中的异常表达及其临床意义。方法用SP免疫组化方法检测hPOT1在57例胃癌标本中的表达,同时以10例正常胃黏膜标本做对照。结果57例胃癌标本的表达全阳性,阳性率100%,显著高于正常胃黏膜hPOTl的表达(40%)。浸润至或超过浆膜层的胃癌hPOT1表达强度显著高于未达浆膜层者,Ⅲ/Ⅳ期胃癌明显高于Ⅰ/Ⅱ期胃癌,低分化胃癌高于高分化胃癌(P<0.05)。结论hPOT1在胃癌组织中表达异常增高,提示hPOT1与胃癌的发生、发展有密切的关系,检测hPOT1的表达可能会有助于胃癌的早期诊断和预后。

抗人端粒重复序列结合因子多克隆抗体制备及纯化

目的 制备并纯化抗人端粒重复序列结合因子片段 (TRF133 -277)的多克隆抗体。方法 运用基因工程的方法表达人工TRF133 -277,将表达蛋白经亲和层析大量纯化后免疫白兔 ,制备血清过柱纯化 ,将TRF133 -277 和GST交连于CNBr-活化的Sephrose4B柱 ,血清过GST柱以去除抗GST抗体 ,然后经GST-TRF1柱吸收抗TRF1抗体 ,获得兔抗人TRF1多克隆抗体。结果 用此抗体作为一抗 ,在人膀胱癌细胞总蛋白中检到68KD的特异条带 ,与阳性对照基本一致。 结论 兔抗人TRF1多克隆抗体制备方法有效 ,所获抗TRF133 -277

人端粒保护蛋白hPot1的一种新选择性剪接体的克隆及鉴定

hPot1是端粒单链结合蛋白,在维持染色体末端的稳定性中发挥着重要作用。从前列腺癌细胞C4-2中提取总RNA,以反转录得到的cDNA为模板,扩增全长的hPot1cDNA,发现hPot1基因的一种新的剪接形式。这种新的剪接形式缺失了野生型hPot1基因的第2个外显子,并且造成了读码框架的改变,使翻译提前终止,表达出一段有45个氨基酸残基的短肽。进一步检测表明,这一hPot1mRNA新剪接体广泛存在于多种组织来源的细胞中,提示这一剪接形式可能是细胞调控hPot1功能的一种调节机制。

紫玉兰素A与人端粒G-四链体相互作用的光谱学研究,第一个木脂素类衍生物与G-四链体相互作用（英文）

人端粒G-四链体结构是指端粒末端富含鸟嘌呤(G)的DNA序列在一价阳离子(如K+和Na+)诱导下通过G碱基间Hoogsteen氢键连接形成的DNA二级结构。能够稳定端粒G-四链体的配体通常为端粒酶抑制剂,其可能成为抗肿瘤药物。应用CD,FRET,NMR光谱方法第一次较全面地研究了一种木脂素衍生物,紫玉兰素A(liliflorin A)与人端粒序列dGGG(TTAGGG)3G-四链体HTG21的相互作用,采用分子对接技术进一步研究紫玉兰素A与人端粒序列dTAGGG(TTAGGG)3G-四链体HTG23的结合位点。CD实验数据表明紫玉兰素A提高HTG21解链温度,FRET实验测得4.01μmol·L-紫玉兰素A可以将HTG21稳定温度提高3.2℃。NMR实验结果表明,加入紫玉兰素A三小时后HTG21核磁谱图出现明显变化。分子对接结果表明紫玉兰素A结合到HTG23较宽沟槽上,结合位点为G9,G10,G16和G17。紫玉兰素A是第一个能够选择性稳定人端粒G-四链体HTG21的木脂素类衍生物配体。实验结果为以人端粒G-四链体为靶点的抗肿瘤药物设计提供了新型候选化合物。

人端粒逆转录酶与Snapin蛋白相互作用的鉴定

目的:研究人端粒逆转录酶(hTERT)与Snapin蛋白的相互作用。方法:将hTERT基因和Snapin基因分别构建到pGBKT7和pGADT7载体中,用酵母双杂交方法在酵母中验证其相互作用;在293T细胞中,共转染带有Flag标签的hTERT及带有GFP标签的Snapin质粒,进行免疫共沉淀;将GST融合的Snapin纯化蛋白与hTERT进行GST-pull down,验证其相互作用。结果:3种方法都证明hTERT能够与Snapin相互作用。结论:Snapin蛋白能够与hTERT相互作用,为研究Snapin参与调控端粒酶的功能活动提供了一些线索。

人端粒保护蛋白（hPOT1）的研究进展

2001年，Baumann等发现并鉴定出人端粒保护蛋白（human protection of telomeres，hPOT1），它是至今发现的唯一能与人类端粒单链DNA结合的蛋白质。hPOT1最重要的功能是对端粒有直接而重要的保护作用。hPOT1能直接与端粒DNA富G单链结合，似“帽子”戴在染色体两端，防止端粒DNA序列丢失、降解、重组，人们形象地称hPOT1为“端粒保镖”。

人端粒保护蛋白（hPOT）的研究进展

2001年，Baumann等发现并鉴定出人端粒保护蛋白（humanprotection of telomeres，hPOT1），它是至今发现的唯一能与人类端粒单链DNA结合的蛋白质。hPOTl最重要的功能是对端粒有直接而重要的保护作用。hPOTl能直接与端粒DNA富G单链结合，似“帽子”戴在染色体两端，防止端粒DNA序列丢失、降解、重组，人们形象地称hPOT1为“端粒保镖”。hPOT1与其他重要的端粒结合蛋白、端粒酶等相互作用共同完成端粒长度调节。其表达水平下降所引起的端粒功能异常以及染色体畸变，恶性肿瘤的发生发展有密切的关系。

人端粒重复序列结合蛋白研究进展

近年来研究表明,端粒重复序列结合蛋白在调节端粒的长度和功能方面起着十分重要的作用。这种作用依赖或不依赖于端粒酶,与细胞衰老和肿瘤发生、发展有密切关系。本文介绍近年来发现的一些重要的端粒重复序列结合蛋白研究进展。

华蟾素联合化疗在食管癌中对人端粒逆转录酶表达的影响

目的:探讨华蟾素注射液联合化疗对食管癌患者人端粒逆转录酶表达影响并分析其意义。方法:采用RT-PCR法检测30例华蟾素联合化疗患者及30例单纯化疗患者外周血hTERT mRNA阳性表达率。结果:联合用药组外周血hTERT MRNA阳性率为53.3%(16/30),单纯化疗组为86.7%(26/30),联合用药组较化疗组明显降低(P<0.05)。结论:华蟾素联合化疗对食管癌患者人端粒逆转录酶表达有明显抑制作用,增强了抗肿瘤疗效,改善治疗预后。食管癌患者外周血hTERT mRNA表达水平的检测,有助于食管癌的早期诊断、肿瘤细胞微转移的诊断、近期疗效评估和预后判断。

人端粒i-motif:结构、识别和生物学功能

人端粒i-motif是由人端粒末端富含胞嘧啶(cytosine,C)的核酸序列形成的特殊高级结构,在端粒重复序列RNA(telomeric repeat-containing RNA,TERRA)转录调控、端粒功能维持和端粒酶活性抑制等方面发挥重要作用。端粒i-motif与多种癌症的发生密切相关,是癌症治疗的一个新靶点。相对于核酸G-四链体等高级结构,端粒i-motif稳定性较差,且受溶液pH、离子状态和拥挤环境等的影响,其在近中性的生理环境下能否稳定形成,长久以来存在争议。采用体外筛选的小分子配体特异性识别并稳定端粒i-motif,为探究该结构的生物学功能以及以端粒为靶点的癌症治疗提供了新策略,是目前的研究热点。但相对于其他核酸高级结构,目前所报道的端粒i-motif特异性配体分子仍较为匮乏。因此,本文将简要介绍i-motif结构的发现历程及其结构特征,并着重对体外环境下人端粒i-motif稳定性的影响因素,以及目前已报道的端粒i-motif配体分子及其生物学功能和调控机制等进行综述。文章内容将为近生理条件下端粒i-motif的结构研究和以其为靶点的特异性配体筛选提供基础,同时也为人端粒相关的癌症机制探究和治疗策略开发等提供思路与方向。

端粒重复序列结合因子在肾脏肿瘤中的表达水平

目的 :研究 TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤及相应癌旁组织中的表达水平。方法 :定量分析肾组织中 TRF1蛋白的表达水平 ,应用经倍比稀释的 TRF13 3 -2 77纯化蛋白作为定量标准 ,建立了以抗 TRF13 3 -2 77单抗作定量 Wes-tern- blot的方法 ,并以该方法检测 TRF1蛋白在组织中的表达水平。结果 :32例肾肿瘤样本均不同程度的表达TRF1蛋白质 ,均值为 2 .4 2 8± 1.35 2 μg/ μl,癌旁自身对照组织 TRF1的表达水平为 3.6 11± 1.92 2 μg/ μl(t=5 .776 ,P<0 .0 0 1)。肿瘤组织内 TRF13 3 -2 77表达水平较相应癌旁组织显著降低 ,并与肿瘤的恶性程度相关 ,差异具有显著性意义 (P<0 .0 1)。结论 :TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤中的表达明显减低 ,并与肿瘤恶性程度呈负相关。

纳米金-Nafion修饰金电极电化学阻抗法测定人端粒DNA

报道了基于纳米金-Nation修饰金电极检测人端粒DNA的电化学阻抗传感器。将纳米金与Nation混合超声得到纳米金-Nation纳米材料，将此纳米材料滴涂于金电极表面获得纳米金．Nation修饰电极。再将探针人端粒ssDNA滴涂在修饰电极上制备电化学阻抗传感器。利用扫描显微镜对纳米材料的形貌进行了表征。利用循环伏安法和电化学阻抗法对传感器进行了表征及目标人端粒DNA的定量测定。在最优化实验条件下，电化学阻抗传感器响应信号（△Ret）与目标人端粒DNA浓度的对数（1gc）在0．001～1．0nmol/L范围内呈良好线性关系。检出限为3．0pmol／L。对0．5nmol／L的目标人端粒DNA7次平行测定，相对标准偏差RSD为3．5％。

抗人端粒重复序列结合因子(TRF1^(33-277))单克隆抗体的制备及生物学特性初步鉴定

目的 制备抗人端粒重复序列结合因子片段 (TRF13 3 2 77)单克隆抗体 (单抗 ) ,探讨其生物学特性。方法 以GST TRF13 3 2 77融合蛋白为抗原 ,经细胞融合及ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞 ,对其进行染色体核型分析 ,将此单抗作为探针用于Westernblot和免疫组化检测标本。结果 获得1个抗TRF1蛋白的杂交瘤细胞株。以抗TRF13 3 2 77单抗作Westernblot检测正常人及急性白血病患者骨髓、大肠癌组织及近旁正常粘膜组织提取蛋白 ,在相对分子质量 6 0 0 0 0处有一特异性条带 ,与阳性对照纯化TRF1蛋白相一致 ,免疫组化显示该抗体在上皮细胞及骨髓造血细胞胞浆中阳性着色。结论 制备了具有高度特异性的抗TRF13 3 2 77单抗 ;建立了Westernblot和免疫组化检测组织表达TRF1蛋白的方法。