人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的:构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子驱动的增强绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体,研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法:从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上,酶切获取约1100bp的启动子片段,克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中,构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒(CMV)启动子的质粒pEGFP-N1作为阳性对照,pEGFP-1作为阴性对照,脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D,NCI-H446,A2,A549,LTEP-a-2,YTMLC和人正常细胞MRC-5,荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果:双酶切和单酶切均显示载体pEGFP-hTERTp构建成功。细胞转染结果显示:在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达,而在MRC-5中无EGFP表达;转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论:hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。

端粒酶hTERT亚单位启动子靶向性慢病毒对肿瘤活体实时显像的实验研究

目的构建一种含优化型人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的慢病毒,结合小动物活体光学成像系统,研究该启动子对端粒酶阳性肿瘤的特异性活体成像作用。方法将文献报道的优化型hTERT启动子克隆到pGL-Basic质粒,对优化型hTERT启动子进行功能检测。确定其驱动活性之后,构建一种含该启动子和GFP的第3代慢病毒表达系统,以含CMV启动子的慢病毒作为对照。采用小动物荧光成像系统体内外研究优化型hTERT启动子在肿瘤实时诊断中的作用。结果启动子功能检测发现hTERT启动子具有严格的端粒酶阳性肿瘤细胞特异性,并且具有很高的报告基因报答水平。第3代慢病毒包装系统获得了高滴度的病毒颗粒并且能高效整合报告基因之宿主细胞。体外研究表明,含有优化型hTERT启动子的慢病毒体外感染细胞后,能够在端粒酶阳性肿瘤细胞内特异表达GFP,并且能维持长达40d的报告基因表达时间。体内实验发现,感染含优化型hTERT启动子的慢病毒之后24h,端粒酶阳性活体肿瘤能够被特异性的实时观察到,并且肿瘤内的GFP信号在存活裸鼠体内维持30d,随肿瘤增大而增强。结论优化后hTERT启动子对报告基因的调控具有严格的端粒酶特异性,第3代慢病毒系统可将该启动子和报告基因整合至细胞基因组,并实现在端粒酶阳性肿瘤细胞内的特异表达。结合小动物活体光学成像系统,荷瘤裸鼠内的端粒酶阳性肿瘤能够被无创的、实时的、特异性的成像,为肿瘤的特异性早期诊断提供新的实验理论基础。

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK靶向性表达治疗肺癌的体内外实验研究

目的研究人类单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)治疗系统在人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的调控下对肺癌细胞A549的体外靶向性增殖抑制作用和对裸鼠体内A549移植瘤的治疗效果。方法1用已构建的hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549及端粒酶阴性的人胚肺细胞MRC-5,RT-PCR方法检测转染细胞中TK基因的表达情况;2MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;并应用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡的影响;3将A549细胞接种于裸鼠皮下,研究pGL3-hTp-TK/GCV和pGL3-SV40-TK/GCV对移植瘤的体内生长抑制作用。结果1转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞也有TK mRNA表达,但MRC-5细胞无TK mRNA表达;2GCV对转染pGL3-SV40-TK的A549、MRC-5细胞和转染pGL3-hTp-TK的A549细胞的体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无明显抑制作用;转染pGL3-SV40-TK和pGL3-hTp-TK的A549细胞经GCV处理后细胞凋亡指数(分别为21.58%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549细胞及空白对照,转染pGL3-SV40-TK的MRC-5细胞凋亡指数(9.35%)显著高于对照组,而转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高;3pGL3-SV40-TK/GCV和pGL3-hTp-TK/GCV治疗系统对裸鼠A549移植瘤的生长具有明显抑制作用,抑瘤率分别为46.7%和40.5%,均显著高于各阴性对照组(分别为9.7%,14.3%,7.0%和8.0%)。结论hTERT启动子可以调控HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向性表达,HSV-TK/GCV治疗系统在hTERT启动子调控下对肺癌细胞A549的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用。

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK肿瘤细胞特异性表达载体的构建

将自杀基因TK插入质粒pGL3--hTp和pGL3-Control中,取代其上的荧光素酶基因,分别构建hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK,酶切和PCR鉴定结果显示重组质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK构建成功;用脂质体法将pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK瞬时转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,RT-PCR显示转染pGL3-SV40-TK的细胞A549和MRC-5均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞中也有TK mRNA表达,但转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无TK mRNA表达.提示hTERT启动子可以调控自杀基因HSV-TK在肺癌细胞中靶向表达,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件.

人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的克隆及其在人肺癌细胞中转录活性的研究

目的 克隆人端粒酶催化亚单位 (hTERT)的启动子 ,并检测它在多种人肺癌细胞株和人胚肺成纤维细胞株中的转录活性 ,为肺癌靶向性基因治疗的研究奠定基础。方法 以人胚肾 2 93细胞基因组DNA为模板 ,应用PCR方法克隆hTERT 5′端上游旁侧序列长约 1.1kb的启动子片段 ,经DNA测序无误后克隆入荧光素酶报告质粒 pGL3 Basic的荧光素酶基因上游 ,构建 pGL3 hTERTp重组质粒 ,用脂质体法瞬时转染人肺癌细胞株A5 49、SPC A 1、LTEPa 2、NCI H44 6、YTMLC、GLC 82、A2 ,以及人胚肺成纤维细胞株MRC 5 ,转染 48h后检测hTERT启动子在各细胞株中的转录活性。结果 琼脂糖凝胶电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约 1.1kb。DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致 ,其 5′端和 3′端分别位于hTERT基因转录起始位点上游 112 6bp和 43bp ,片段长度为 10 84bp。采用双酶切和PCR两种方法鉴定 pGL3 hTERTp重组质粒 ,均显示构建成功。瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示 ,hTERT启动子在所检测的肺癌细胞株中均有高低不同的转录活性 ,而在MRC 5细胞株中无转录活性。结论 该实验克隆的 10 84bp大小的hTERT启动子在多种肺癌细胞株中均有转录活性 ,在人胚肺成纤维细胞中无转录活性。

端粒酶催化亚基启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗的研究进展

近年来,端粒酶是肿瘤研究领域的热点之一,是一种核糖核酸蛋白体复合物,在绝大多数恶性肿瘤细胞中呈阳性表达,而在正常体细胞中则一般为阴性。端粒酶的活性主要是受人端粒酶催化亚单位基因的转录调控,而人端粒酶催化亚单位基因的转录主要受其启动子的调控。因此,人端粒酶催化亚单位启动子介导的使抗肿瘤基因在肿瘤细胞内靶向表达的基因治疗是肿瘤基因治疗的热点。本文对此进行了综述,旨在为肿瘤的基因治疗提供新思路。

不同病变胃粘膜端粒酶活性及其亚单位的检测

目的：探讨端粒酶及其亚单位（ＴＰ１、ｈＴＲ、ｈＴＲＴ）在胃粘膜癌变过程中的作用。方法：端粒酶的检测采用端粒末端重复序列扩增技术（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｒｅｐｅａｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ＴＲＡＰ），端粒酶亚单位的检测采用ＲＴ－ＰＣＲ法。结果：端粒酶阳性检出率在慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生及胃癌中分别为２４．６％（１４／５７）、３８．９％（７／１８）、３７．５％（３／８）及９２．３％（６０／６５），正常胃粘膜未检测到端粒酶活性，与以上各病变组织有显著性差异（Ｐ＜０．０５～０．０１），而慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和异型增生组织中端粒酶阳性率亦明显低于胃癌组织（Ｐ＜０．０１）；端粒酶的表达与临床病理指标无相关性；ＲＴ－ＰＣＲ定性检测发现端粒酶亚单位ｈＴＲ和ＴＰ１在大多数胃粘膜中都有表达，而ｈＴＲＴ主要在胃癌及部分癌前组织中表达，且在胃癌中ｈＴＲＴ的表达与端粒酶活性之间具有明显的相关性（Ｐ＜０．０１）。结论：端粒酶不仅在胃癌组织中高表达，在部分癌前组织中也有表达。提示端粒酶在胃癌的发生过程中可能具有重要作用；端粒酶亚单位ｈＴＲＴ不仅可能作为胃癌的诊断指标，而且还可能作为胃癌基因治疗的靶?

人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（ｈＴＲＴ）反义基因治疗对胃癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 采用基因重组技术，构建ｈＴＲＴ正、反义真核表达载体，采用脂质体法导入ＳＧＣ－７９０１细胞，检测细胞生长曲线、端粒酶活性凋亡、细胞周期、软琼脂中克隆形成率及裸鼠体内成瘤性的变化。结果 成功构建ｈＴＲＴ正、反义真核表达载体，并导入ＳＧＣ－７９０１胃癌细胞株中，获得稳定表达正、反义基因的细胞系７９０１－Ｓ、７９０１－ＡＳ１和７９０１－ＡＳ２。７９０１－ＡＳ１和７９０１－ＡＳ２出现显著生长抑制现象，端粒酶活性明显下降，细胞凋亡增加，异型性减小，Ｇ０／Ｇ１期细胞增加，Ｓ和Ｇ２Ｍ期细胞减少，增殖指数减小，软琼脂中无克隆形成，裸鼠体内成瘤消失。结论ｈＴＲＴ反义基因治疗可以明显抑制ＳＧＣ－７９０１细胞的增殖，部分逆转肿瘤细胞的恶性表型，其机制可能主要是通过诱导细胞分化而非诱导细胞凋亡途径实现的，提示ｈＴＲＴ基因可以作为肿瘤治疗的靶基因。

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子序列片段,并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5′端上游旁侧序列长约1.1 kb的启动子片段,经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL 3-B as ic的荧光素酶基因上游,构建pGL 3-hTERT p重组质粒,瞬时转染肺癌细胞A 549、SPC-A-1、LTEPα-2、NC I-H 446、YTM LC-9、GLC-82、95D、A 2以及正常成纤维细胞M RC-5,检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-EL ISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1.1 kb,DNA测序结果与G enB ank中hTERT启动子DNA序列完全一致,位于hTERT基因转录起始位点上游1126 bp(-1126^-40),片段长度为1084 bp;采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL 3-hTERT p重组质粒,均显示构建成功;hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达,而正常细胞则均为阴性;瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示,hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性,在正常细胞M RC-5无转录活性。结论克隆的1084 bp大小的hTERT启动子片段在hTERTmRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性,hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。

细胞因子诱导人脐血间充质干细胞分化过程中细胞巢蛋白、神经丝亚单位和端粒酶逆转录酶mRNA的表达

目的:观察细胞因子EGF和bFGF联合诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化过程中细胞 巢蛋白(nestin)、神经丝亚单位M(NF M)和端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的变化。方法:采集健康自然分娩产 妇脐血,密度梯度离心分离单个核细胞(MNCs),PBS洗涤2次后重悬于含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12 中,接种于T 75培养瓶内(细胞密度为1×106ml-1),一组加入细胞因子EGF和bFGF,终浓度各为10μg/L,另一 组不加细胞因子,剩余细胞用液氮冻存。培养24h倾去全部液体以除去未贴壁细胞,以后每3d全量换液1次,倒 置显微镜下观察细胞形态。分别收集培养1d、4d、7d、14d贴壁细胞和冻存细胞,采用RT -PCR方法检测nestin、 NF M、hTERTmRNA的表达。结果:未培养的脐血MNCs(内含MSCs)nestin、NF M、hTERTmRNA均表达阳性。培 养后nestin、hTERTmRNA表达下降,至第7d已不能检出;而NF MmRNA的表达随培养时间延长而增强。与对照 组相比,细胞因子组NF MmRNA表达较高,nestin、hTERTmRNA表达的下降趋势延迟。结论:细胞因子EGF和 bFGF在联合诱导脐血MSCs分化为神经细胞的过程中,能下调hTERTmRNA的表达。

榄香烯对HeLa细胞端粒酶催化亚单位基因表达的作用

目的 :探讨HeLa细胞凋亡过程中 ,人乳头瘤病毒 18型E6 (HPV18 E6 )基因、p5 3基因、端粒酶催化亚单位 (hTERT)基因表达的变化 ,为临床诊断、治疗宫颈癌提供新思路。方法 :用流式细胞仪、电镜证实细胞凋亡 ;用PCR和RT PCR方法研究HPV18 E6基因、p5 3基因、hTERT基因表达在细胞凋亡过程中的变化及相互关系。结果 :在榄香烯作用下 ,HPV18 E6基因、p5 3基因表达没有变化 ,但hTERT基因表达受到抑制。结论 :榄香烯诱导HeLa细胞凋亡过程中 ,hTERT基因表达受到明显抑制 ,对于耐药性肿瘤 。

hTRT反义基因转染对肝癌细胞端粒酶亚单位及细胞周期的影响

目的 探讨人端粒酶蛋白催化活性亚单位 (Humantelomerasereversetranscriptase ,hTRT)反义基因转染对HepG2 肝癌细胞株端粒酶亚单位及细胞周期的影响。方法 采用流式细胞仪检测hTRT正义基因转染的HepG2 细胞(HepG2 S)以及hTRT反义基因转染的HepG2 细胞 (HepG2 AS)的细胞周期 ,采用RT PCR法检测上述细胞hTRT、端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白 1(TP1)以及c myc和bcl 2基因的变化 ,同时采用Westernblot检测hTRT蛋白质的变化。结果 HepG2 AS出现G0 G1 期阻滞 ,增殖指数增加 ,凋亡率亦明显增加 ,进一步研究发现 ,HepG2 AS端粒酶亚单位hTRT在蛋白质和mRNA水平均表达减少 ,而TP1、hTR无明显变化 ,bcl 2和c mycmRNA的表达亦明显下调。结论 hTRT反义基因不仅可以下调HepG2 细胞hTRTmRNA和蛋白质的表达 ,而且可以下调c myc、bcl 2mRNA的表达 ,从而一方面降低端粒酶活性 ,另一方面一定程度增加凋亡细胞的比率 。

端粒、端粒酶及其亚单位在鼻咽癌中相互作用的研究

目的 探讨端粒、端粒酶及其亚单位在鼻咽癌发病中的作用。方法 采用Southern杂交等分子生物学方法对鼻咽癌端粒、端粒酶及其亚单位进行检测。结果 鼻咽癌平均端粒长度 (MTL)为 4 .5± 2 .3kb ,端粒酶阳性表达为 88.0 %～ 10 0 %。对照组MTL分别为 14 .6± 2 .8Kb和 15 .8± 3.8Kb ,癌旁组织端粒酶阳性表达为 6 4.7% ,对照组为 0～ 8.7%。此外 ,端粒酶活性增高与晚期鼻咽癌及其颈淋巴结转移也有密切关系。结论 端粒及端粒酶与鼻咽癌的发生。

端锚酶反义寡核苷酸联合反义端粒酶催化亚单位对人肺腺癌A549细胞端粒动力学的影响

背景与目的:端锚酶是真核生物体内的一种重要的功能蛋白,对调节细胞端粒长度及参与细胞衰老和永生化过程起着重要的作用。本研究探讨端锚酶及端粒酶反义寡核苷酸联合作用对人肺腺癌A549细胞端粒相关蛋白表达和翻译的影响,以及对端粒缩短效能和细胞周期的作用。方法:将培养的A549细胞分为空白对照组、端锚酶正义寡核苷酸对照组(tankyrase sense oligonucleotide,sTANKS)、端粒酶催化亚单位正义寡核苷酸对照组(human telomerase reverse transcriptase sense oligonucleotide,shTERT)、端锚酶反义寡核苷酸实验组(tankyrase antisense oligonucleotide,asTANKS)、端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸实验组(human telomerase reverse transcriptase antisense oligonucleotide,ashTERT)、端锚酶及端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸联合实验组(asTANKS+ashTERT)。分别与不同的正、反义寡核苷酸作用,采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)法观察端粒酶催化亚单位的mRNA表达,ELISA-PCR法测定端粒酶活性,Western blot法观察端锚酶活性,Q-FISH法检测各组端粒的平均长度;并通过传代实验观察不同正、反义寡核苷酸对A549细胞传代寿命的影响。结果:ashTERT能明显抑制端粒酶催化亚单位的mRNA表达及蛋白质活性,不影响端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.59±0.07)kb];细胞在经过56.92±0.46个倍增时间(population double,PD)连续培养终止。asTANKS不影响端粒酶催化亚单位mRNA表达及蛋白质活性,却能明显抑制端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.33±0.09)kb];细胞在经过(53.33±0.57)PD连续培养终止。ashTERT+asTANKS联合作用同时抑制端粒酶和端锚酶,其细胞平均端粒长度缩短更为明显[(3.55±0.08)kb],流式直方图上FITC荧光"左偏"更显著,与ashTERT、asTANKS比较差异有显著性(t=37.33、32.50,P<0.001);ashTERT+asTANKS组细胞在经(24.53±0.40)PD后培养终止,与ashTERT、asTANKS比较差异也有显著性(t=53.38、43.39,P<0.001)。结论:端锚酶反义寡核苷酸对A549细胞端粒长度的抑制有别于端粒酶途径,它不仅能通过影响端锚酶活性,缩短A549细胞端粒的平均长度,而达到缩短肿瘤细胞生存寿命的目的;而且可与端粒酶抑制剂产生协同作用,明显缩短肿瘤细胞的生存周期,可能成为抗癌作用的新靶点。

针对端粒酶蛋白催化亚单位的肿瘤免疫治疗研究

端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)相对分子质量Mr 127 000, 包含1 132个氨基酸,其基因位于5号染色体短臂的最末端(5p15.33),在90%以上的人类肿瘤中高表达,而正常成熟组织中则基本没有表达,可作为广谱的抗肿瘤治疗分子靶点.DC是已知体内激活静息T细胞功能最强的专职抗原递呈细胞,经DC递呈hTERT抗原表位信息后,CTL能识别从hTERT提取的多肽表位,并在体外杀伤多种组织来源的hTERT阳性的肿瘤细胞.因此hTERT是迄今发现的一个最具应用前景的肿瘤广谱相关抗原,针对hTERT的肿瘤免疫基因治疗有可能成为肿瘤免疫治疗的又一研究热点.

端粒酶催化亚单位转染血管内皮细胞的实验研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位转染血管内皮细胞后,血管内皮细胞增生活性的变化。方法 应用胶原酶消化法培养脐静脉血管内皮细胞(UE),ABC法检测内皮细胞CD34表达。脂质体介导内皮细胞转染,MTT法测定细胞代谢活性并测定细胞生长曲线。基于逆转录聚合酶链反应的端粒重复末端扩增分析法检测端粒酶活性表达。结果 培养的细胞贴壁后为单层呈铺路石状排列。细胞爬片CD34染色呈阳性,pBABE-HYGRO-hERT转染内皮细胞测定端粒酶活性的吸光度为0.889。MTT实验表明:在各个时间点转染阳性细胞(HC)的吸光值都高于脐静脉血管内皮细胞(UE)(P<0.05)。UE与HC的细胞生长曲线形态相似,8 d内HC数量增长了约4倍。在各个时间点:HC较UE细胞数多(P<0.05)。结论 pBABE-HYGRO-hTERT转染内皮细胞后,提高了内皮细胞端粒酶的活性和增殖能力。

人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测

目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定量测定人 β 肌动蛋白 (hBA)的mRNA作为内对照。用梯度稀释的克隆的人 β 肌动蛋白基因制作标准曲线。结果 :标准曲线的相关系数为 1.0 0。实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为 7.1%。HepG2细胞hTERTmRNA与hBAmRNA的比值为 (1.3± 0 .3)× 10 -4。结论 :建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。

霍乱毒素B亚单位工程菌MM2的表达与lac启动子的关系

研究了不同碳源(葡萄糖、乳酸和乙酸)以及IPTG诱导对工程菌MM2表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的影响,ctb基因位于lac启动子的下游。在YC培养基中分别加入0.048mol/L的葡萄糖、0.102mol/L的乳酸和0.167mol/L的乙酸,它们在完全氧化后可产生相同的能量。结果表明,加入葡萄糖会大幅度降低ctb基因的表达水平,其原因和培养过程中pH值下降有关;加入乳酸可提高ctb基因表达水平1.15倍,且不抑制菌体生长;加入乙酸可提高ctb基因的表达水平0.9倍,但对菌体生长有抑制作用。不同时间及不同浓度的IPTG诱导未能提高ctb基因的表达水平,说明lac启动子对ctb基因的表达没有影响或影响很小。

人端粒酶催化亚单位基因单核苷酸多态性与胃癌的关系

目的探讨人端粒酶催化亚单位基因（human telomerase catalytic subunit，hTERT）Ex2-659A／G位点单核苷酸多态性与胃癌患者发病风险的关系。方法对甘肃西部三家医院外科手术切除168例胃癌患者（病例组）和同期在上述医院查体的健康人群156例（对照组）进行病例对照研究；采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术（PCR—RFLP）对2组进行基因型分析，比较各基因型分布频率和发病风险的关系。结果病例组hTERT Ex2-659A／G位点AA、AG、GG基因型的频率与对照组相比无显著差异。病例组A、G等位基因频率分别为44．74％和55．26％，对照组为43．42％和56．58％，2组A、G等位基因型频率比较有显著性差异（χ^2=5．3734，P=0．0204）。与G／G基因型相比，A／G和A／A2种基因型的个体患胃癌的危险度（OR）分别为0．519（95％CI：0．310—0．870，P=0．013）、0．550（95％CI：0．255～1．188，P=0．128）。结论hTERT Ex2-659A／G单核苷酸多态性可能为胃癌的保护因素。

hTERT基因转染对人胚胎成纤维细胞端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响

为了探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位 (hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞 (hEFs)端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响 ,采用基因重组技术构建hTERT全长cDNA正义荧光真核表达载体 ,并采用脂质体法将正义重组质粒pIRES2 EGFP hTERT及空载质粒pIRES2 EGFP分别转染原代培养hEFs,检测转染细胞端粒长度、端粒酶活性及端粒酶亚单位的变化。结果显示 ,外源性hTERT基因转染细胞 (hEF hTERT)端粒酶活性较未转染细胞 (hEFs)及空载体转染细胞 (hEF EGFP)显著增加 (P <0 0 1) ,hEF hTERT、hEFs及hEF EGFP端粒长度分别为 6 0kb、5 3kb及 5 4kb ,端粒酶亚单位中除hTERT在mRNA和蛋白水平表达均增加外 ,hTR和TP1mRNA无明显变化。以上结果提示 ,外源性hTERT基因转染能使原代培养的hEFs端粒酶活化 ,端粒长度不再继续缩短 ,hTERT在mR