人端粒酶催化亚基基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体

为获得端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达载体用于癌症的基因治疗 ,克隆并构建了人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因启动子调控的萤光素酶报告载体 .用脂质体转染法将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞 ,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性 .hTERT启动子在所检测的 4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性 ,平均为阳性对照的 4 4 3% ;而在端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞中则无明显的转录活性 .提示hTRET启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调 。

人端粒酶催化亚基和SV40大T抗原永生化猪脐静脉血管内皮细胞

为建立稳定的猪血管内皮细胞系,用于猪瘟病毒(CSFV)的致病机理研究提供理想的细胞模型,本研究利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40 LT)基因进入猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),通过G418或嘌呤霉素筛选阳性克隆,并进行细胞传代研究和细胞形态学及表型鉴定。分别获得了两种方法建立的永生化猪血管内皮细胞系SUVEC-hT和SUVEC-ST。两种细胞系均呈铺路石样单层排列生长,具有高度的增殖活性,在传代70代后不表现任何衰老细胞的特征,并保持接触生长抑制。SUVEC-hT细胞系持续表达hTERT、CD31、CD34和von Willebrand factor,并能摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)。SUVEC-ST细胞系持续表达SV40 LT、CD31和CD34,并能摄取Dil-Ac-LDL。两个细胞系均保持正常的核型并对CSFV敏感。结果表明通过表达外源的hTERT或SV40 LT,SUVEC已被永生化,并且保留了血管内皮细胞的主要生物学特征。

大肠癌端粒酶活性的意义及其与人端粒酶催化亚基表达的相关性

目的 :研究大肠癌组织中端粒酶活性在大肠癌发生发展中的作用及其与人端粒酶催化亚基 (h TERT)表达的相关性。方法 :运用 PCR- TRAP- EL ISA及免疫组织化学方法 (免疫组化法 )对 30例大肠癌及相应的癌旁组织、正常大肠组织及 2 0例大肠腺瘤性息肉组织中端粒酶活性和 h TERT表达进行检测。结果 :1端粒酶在大肠癌组织中的阳性表达明显高于癌旁组织、正常大肠黏膜及大肠腺瘤性息肉 (P<0 .0 5 ) ;2大肠癌组织端粒酶与淋巴结转移关系密切 ,伴淋巴结转移大肠癌端粒酶阳性表达率明显高于无淋巴结转移者 (P <0 .0 1 ) ;3相关分析显示端粒酶活性与 h TERT表达存在相关性 (P <0 .0 5 )。结论 :端粒酶在大肠癌的发生发展过程中可能起着重要作用 ,h

人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

背景:人端粒酶催化亚基与c-myc在喉鳞状细胞癌中有密切的相关性。目的:构建含有c-myc启动子的人端粒酶催化亚基的重组腺病毒载体,观察人端粒酶催化亚基在细胞中表达后对细胞增长的影响。方法:按照人工合成中反向转录的方法设计基因合成引物,用复式PCR获得目的片段ashTERT(322bp)。将片段ashTERT克隆到pUC57(2.7kb)克隆载体,然后热激转化到E.coli感受态细胞中,菌检、PCR、鉴定阳性克隆后,菌液放大培养,提取质粒pUC57-ashTERT,然后对质粒进行测序。将目的基因片段亚克隆到穿梭载体pshuttle-CMVneo上,然后构建重组腺病毒质粒pAd-ashTERT。转入293细胞中进行病毒包装、鉴定和滴度测定。结果与结论:提取质粒pUC57-ashTERT,测序符合序列要求。质粒pUC57-ashTERT转入293细胞后,成功构建了有较强感染能力的含人端粒酶催化亚基基因的重组腺病毒载体。

人端粒酶催化亚基肿瘤相关性研究

人端粒酶催化亚基（hTERT）基因转录的从头激活是端粒酶活化的主要限速步骤，受到多种癌基因或抑癌基因产物的精密调控。构建hTERT启动子调控抗肿瘤基因的逆转录病毒载体，使抗肿瘤基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞内定向表达，有望用于肿瘤基因治疗。

人端粒酶催化亚基基因启动子克隆及转录活性的评价

为检测人端粒酶催化亚基(hTERT)基因启动子,克隆构建hTERT启动子(319 bp)调控的荧光素酶报告载体,用脂质体转染法将其转染肿瘤细胞和正常细胞。结果表明,hTERT启动子在所检测的4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性,平均为阳性对照的44.3%;而在端粒酶阴性的正常成纤维细胞株中则无明显的转录活性。结论:hTERT启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调,由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的靶向性基因治疗载体。

苦参碱对腺样囊性癌细胞周期阻滞和端粒酶催化亚基表达的影响

目的观察中药苦参有效成分苦参碱对涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞的细胞周期及端粒酶催化亚基(hTERT)表达的影响。方法体外培养ACC-M细胞,用不同浓度的苦参碱对体外培养的ACC-M细胞进行干预,以流式细胞仪检测对照组和不同浓度(0.25、0.50、0.75、1.00mg·mL-1)苦参碱作用不同时间后细胞周期的变化;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测苦参碱作用48h后细胞hTERT mRNA的表达改变;流式细胞术定量检测hTERT蛋白的表达变化。结果苦参碱作用后明显抑制ACC-M细胞的增殖,使ACC-M细胞周期阻滞于G0/G1期,并与药物浓度和作用时间呈正相关;苦参碱作用后hTERT基因和蛋白表达明显下降。结论苦参碱对ACC-M细胞有明显细胞周期阻滞作用,同时显著下调hTERT基因表达。细胞周期阻滞作用可能与苦参碱下调hTERT基因表达有关。

人端粒酶催化亚基反义核酸对子宫内膜癌细胞的抑制作用

目的 探讨人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因反义寡核苷酸 (AODN)对子宫内膜癌细胞系HEC 1A的生长抑制作用及作用机理。方法 采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测AODN对细胞增殖能力及细胞生长的影响 ;逆转录聚合酶链反应技术 (RT PCR)、定量端粒酶重复扩增法 (TRAP)、Westernblot蛋白免疫印迹法和凋亡相关酶活性测定检测反义核酸对hTERT基因转录、蛋白表达、细胞端粒酶活性以及凋亡相关酶活性的变化。结果 低浓度hTERT基因AODN能够下调HEC 1A细胞hTERTmRNA含量 ,抑制细胞hTERT蛋白表达 ,下调端粒酶活性 ,并且激活凋亡相关酶Caspase 1和Caspase 3活性 ;其对细胞的生长抑制作用有明显的时效性和剂量依赖性。结论 hTERT基因反义核酸能够抑制子宫内膜癌细胞的增殖能力 ,有望成为内膜癌治疗的新方向。

人端粒酶催化亚基基因反义寡核苷酸对卵巢癌细胞端粒酶活性及细胞生长的影响

目的 探讨人端粒酶催化亚基 (hEST2基因 )反义寡核苷酸 (AODN)对卵巢癌细胞系SKOV3、COC1细胞端粒酶活性及细胞生长的影响。方法 分别采用逆转录聚合酶链反应技术、端粒重复扩增法、四甲基偶氮唑蓝法、绘制细胞生长曲线的方法检测hEST2基因AODN转染前后SKOV3、COC1细胞hEST2mRNA表达、端粒酶活性的变化 ,以及对细胞增殖能力及细胞生长的影响。结果hEST2基因AODN能够下调SKOV3、COC1细胞hEST2mRNA的表达 ,降低端粒酶活性 ,抑制细胞的生长 ,作用具有明显的时效性。以浓度为 30 μmol/L的AODN治疗 4 8h时作用最显著 ,SKOV3、COC1细胞hEST2mRNA的表达分别下降 5 4 6 %、4 4 6 % ,对两株细胞的端粒酶活性抑制率分别达到 4 7 9%、4 2 7% ,与相同浓度的随机寡核苷酸 (RODN)、正义寡核苷酸 (SODN)相比 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。结论 hEST2基因的反义治疗能够抑制卵巢癌细胞的增殖能力 。

胃癌组织端粒酶活性与催化亚基hTERT表达的关系

目的 :研究胃癌、胃黏膜肠化生及正常黏膜组织端粒酶活性与人端粒酶催化亚基 (hTERT)表达的相关性及端粒酶激活在胃癌发生中的作用。方法 :通过端粒重复序列扩增 (TRAP)和逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法测定 3种胃癌细胞株、2 6例胃癌、1 0例胃黏膜肠化生和 36例正常胃黏膜组织标本端粒酶活性和hTERT表达。结果 :3种胃癌细胞株、2 4例胃癌组织有端粒酶活性 ;4例肠化生端粒酶活性较弱 ;36例正常胃黏膜标本未测到端粒酶活性。hTERT在 2 6例胃癌组织、5例肠化胃黏膜中表达 ;正常胃黏膜无表达。端粒酶活性、hTERT表达与肿瘤的分期和病理分级无关。结论 :hTERT在肿瘤形成的早期阶段表达 ,端粒酶的激活是胃癌形成的关键步骤。

联合干扰人端粒酶催化亚基对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的探讨基因的联合干扰对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法将转染细胞分为共四组:psi-control对照组(A组)、psi-端粒酶催化亚基(hTERT)1组(B组)、psi-hTERT1和psi-hTERT2共转染组(C组)、psi-hTERT1和psi-端粒酶调节相关蛋白(TRAP)1共转染组(D组)。采用RT-PCR及Western blot分别检测hTERT mRNA和蛋白表达,端粒重复序列扩增-PCR法检测端粒酶活性,MTT法检测SGC-7901细胞增殖。结果与A组相比,B组、C组hTERT mRNA和蛋白表达、端粒酶活性降低(P<0.05),细胞增殖减慢,细胞凋亡增加;而D组各指标与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论联合干扰的效果可能与剂量和目的基因有关。

端粒酶催化亚基hTERT在肿瘤治疗中的研究进展

人端粒酶催化亚基hTERT基因转录的从头激活是端粒酶活化的限速步骤,受到多种癌基因和抑癌基因产物的精密调控。构建hTERT启动子调控抗肿瘤基因的逆转录病毒载体,使抗肿瘤基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞内定向表达,有望用于肿瘤基因治疗。本文首先简单介绍了hTERT蛋白的结构和表达调控机制,然后对其在肿瘤发生发展中的生物治疗的功能作一简要综述。

人端粒酶催化亚单位hTERT基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

为构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)重组腺病毒载体,采用PCR法从pCI-neo-hTERT中钓取hTERT全长cDNA,定向克隆到pADTrack-CMV穿梭质粒。通过分步转化把pADEasy-1和重组穿梭质粒(pADTrack-hTERT)转化入BJ5183菌进行同源重组。hTERT重组腺病毒骨架质粒(pAD-hTERT)转染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,收获重组腺病毒(AD-hTERT)提取DNA行PCR鉴定并扩增。经PCR、酶切和测序鉴定证实hTERT的cDNA正确插入穿梭质粒且与pADEasy-1正确同源重组;PCR鉴定及报告基因分析说明hTERT重组腺病毒包装正确且具有较好的感染活力。结果表明本研究已成功构建了hTERT重组腺病毒,为hTERT的神经保护作用研究奠定了基础。

姜黄素抑制HeLa细胞端粒酶的活性

目的研究姜黄素能否抑制HeLa细胞端粒酶活性。方法用MTT法检测姜黄素对HeLa细胞生长的抑制作用,用RT-PCR和半定量TRAP-ELISA法检测HeLa细胞中人端粒酶催化亚基(hTERT)mRNA的表达和端粒酶活性。结果HeLa细胞生长呈剂量依赖性抑制,其端粒酶活性和hTERT的表达也明显下调。结论姜黄素可能通过下调hTERT的表达而抑制HeLa细胞的端粒酶活性。

人端粒酶反转录酶基因转染人胚胎大脑皮质神经元的凋亡

背景:人端粒酶反转录酶重组腺病毒转染原代培养的人胚胎大脑皮质神经元,可以促进细胞生存,抑制凋亡。目的:观察人端粒酶反转录酶对β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)诱导人胚胎大脑皮质神经元凋亡的影响。方法:人胚胎大脑皮质神经元原代培养后,分为3组:对照组、Aβ25-35组和人端粒酶反转录酶组。Aβ25-35组和人端粒酶反转录酶组细胞在培养144 h后,用Aβ25-35 5μmol/L干预24 h。人端粒酶反转录酶组在Aβ25-35 5μmol/L干预72 h进行人端粒酶反转录酶基因转染。结果与结论:原代培养的人胚胎大脑皮质神经元培养7 d后,出现凋亡细胞,而Aβ25-35干预后使凋亡细胞数量增加,而人端粒酶反转录酶可防止Aβ25-35诱导的人胚胎大脑皮质神经元的凋亡。

小鼠胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的永生化研究

本文探讨了小鼠胚胎干细胞(ES细胞)诱导分化的血管内皮细胞永生化。在体外培养系统中,以维甲酸(RA)和转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的拟胚体(EB)分化为“圆形细胞”和由这些“圆形细胞”组成的血管样结构。经光学和扫描电镜及免疫荧光等法分析检测,证明组成血管样结构的细胞具有专一性vWF荧光染色,表明是血管内皮样细胞。利用脂质体将人端粒酶催化亚基逆转录酶(hTERT)基因转染诱导分化中的“圆形细胞”。应用Dot-blot,RT-PCR,Western blot及免疫组织化学等方法分析、观察和证明了诱导分化的组成血管样结构的园形细胞和被hTERT基因转染的“圆形”细胞的形态和生物学特性。结果表明,携带hTERT基因的从ES细胞分化来的圆形细胞在体外可大量增殖,持续传代,95%具有血管内皮细胞的一些特有标志和管道化生长特性。因此,通过人端粒酶基因的转染途径可解决由ES细胞诱导分化而来的内皮细胞扩增和永生化问题,为构建组织工程化血管及其它人工血管的内皮化提供种子细胞来源打下基础。

hTERT基因转染对人胚胎大脑皮质神经元生长的影响

目的观察hTERT基因转染后对人胚胎大脑皮质神经元生长活力的影响。方法制备pSU-CMV-hTERT腺病毒,以MOI感染人胚胎大脑皮质神经元。免疫细胞化学荧光染色观察神经元内hTERT表达。MTT法测量接种病毒后24h、72h、1周、2周、3周的神经元活力。结果经鉴定正确的重组质粒pSU-CMV-hTERT与骨架质粒正确重组,经包装扩增后得到含hTERT基因的腺病毒。病毒转染24h时荧光染色可见神经元内有hTERT表达,第3周末表达减弱。hTERT基因转染后的神经元平均活力较对照组高,转染病毒后24h、72h、1周、2周、3周,hTERT基因转染对神经元的保护率分别为27.4%、42.4%、17.3%、7.4%和15.9%。结论hTERT基因转染对人胚胎大脑皮质神经元有一定的保护作用。

RNAi下调hTERT基因对MCF-7乳腺癌细胞生长的影响

目的利用si RNA在乳腺癌细胞内诱导RNAi,抑制人端粒酶催化亚基(human telomerasereverse transcriptase,hTERT)基因表达,在体外细胞水平探讨RNAi对MCF-7乳腺癌细胞生长的影响。方法构建靶向hTERT基因的siRNA(hTERT-si RNA),转导入MCF-7乳腺癌细胞,在瘤细胞内诱导RNAi,采用细胞增殖抑制实验、RT-PCR法、Western blot等技术检测si RNA处理前后瘤细胞增殖及hTERT基因表达变化。结果 hTERT-si RNA对乳腺癌细胞生长抑制率达61.94%;hTERT的mRNA表达降低了61.7%,蛋白表达平均降低了52.8%。结论 si RNA在体外明显抑制了乳腺癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。

hTERT对干预后人胚胎神经元cdk5 P-CREB表达影响的初步观察

目的对干预后人胚胎神经元周期素依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,cdk5)、cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,P-CREB)表达影响。方法人胚胎大脑皮质神经元原代培养后,用hTERT重组腺病毒转染神经元,用Aβ25-35干预转染后神经元。实验分为转染组和非转染组。Western-blot检测cdk5、p-CREB的变化。结果 Aβ25-35干预后,神经元内cdk5表达量明显增加,而hTERT基因转染组cdk5增加的低于非转染组。干预后神经元内p-CREB表达量明显降低,而hTERT基因转染组,p-CREB表达量高于非转染组。结论 Aβ25-35干预人胚胎大脑皮质神经元,可以导致cdk5的异常活化,p-CREB的降低;hTERT基因转染可有效抑制cdk5的异常激活,防止p-CREB的降低。