苦参碱对腺样囊性癌细胞周期阻滞和端粒酶催化亚基表达的影响

目的观察中药苦参有效成分苦参碱对涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞的细胞周期及端粒酶催化亚基(hTERT)表达的影响。方法体外培养ACC-M细胞,用不同浓度的苦参碱对体外培养的ACC-M细胞进行干预,以流式细胞仪检测对照组和不同浓度(0.25、0.50、0.75、1.00mg·mL-1)苦参碱作用不同时间后细胞周期的变化;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测苦参碱作用48h后细胞hTERT mRNA的表达改变;流式细胞术定量检测hTERT蛋白的表达变化。结果苦参碱作用后明显抑制ACC-M细胞的增殖,使ACC-M细胞周期阻滞于G0/G1期,并与药物浓度和作用时间呈正相关;苦参碱作用后hTERT基因和蛋白表达明显下降。结论苦参碱对ACC-M细胞有明显细胞周期阻滞作用,同时显著下调hTERT基因表达。细胞周期阻滞作用可能与苦参碱下调hTERT基因表达有关。

人端粒酶催化亚基基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体

为获得端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达载体用于癌症的基因治疗 ,克隆并构建了人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因启动子调控的萤光素酶报告载体 .用脂质体转染法将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞 ,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性 .hTERT启动子在所检测的 4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性 ,平均为阳性对照的 4 4 3% ;而在端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞中则无明显的转录活性 .提示hTRET启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调 。

膀胱移性细胞癌尿脱落细胞端粒酶催化亚基检测及临床意义

目的 检测尿脱落细胞端粒酶催化亚基 (hTERT)并探讨其临床意义。方法 用RT PCR法分别对膀胱癌组织、正常膀胱组织以及膀胱移性细胞癌和泌尿系良性疾病患者尿脱落细胞进行hTERT检测。结果 2 7例膀胱癌组织hTERT表达呈10 0 %阳性 ,正常膀胱粘膜 16例均无阳性表达。 3 2例膀胱移行性细胞癌 (transitionalcellcarcinomaofbladder,TCC)患者尿脱落细胞hTERT表达阳性率为 87 5 % ( 2 8/ 3 2 ) ,非肿瘤组表达阳性率为 13 3 % ( 2 / 15 ) ,与TCC病理分级、分期无相关性。结论 检测脱落细胞hTERT是一种无创伤性的、敏感度高、特异性强的方法 ,是TCC早期诊断的一个有价值的辅助指标。

端粒酶催化亚基在腺性膀胱炎中表达意义的研究

目的探讨端粒酶催化亚基(hTERT)在腺性膀胱炎组织中的表达及意义。方法用RT-聚合酶链反应法分别对53例腺性膀胱炎组织、28例膀胱癌组织、25例正常膀胱组织及移行膀胱癌T24细胞株进行hTERT检测。结果腺性膀胱炎组织hTERT表达呈阳性33例(62.3%);28例膀胱癌组织100%呈阳性表达;正常膀胱组织25例均无阳性表达。结论hTERT在腺性膀胱炎组织中的高度表达说明腺性膀胱炎与癌前病变有密切的相关性。

人端粒酶催化亚基和SV40大T抗原永生化猪脐静脉血管内皮细胞

为建立稳定的猪血管内皮细胞系,用于猪瘟病毒(CSFV)的致病机理研究提供理想的细胞模型,本研究利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40 LT)基因进入猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),通过G418或嘌呤霉素筛选阳性克隆,并进行细胞传代研究和细胞形态学及表型鉴定。分别获得了两种方法建立的永生化猪血管内皮细胞系SUVEC-hT和SUVEC-ST。两种细胞系均呈铺路石样单层排列生长,具有高度的增殖活性,在传代70代后不表现任何衰老细胞的特征,并保持接触生长抑制。SUVEC-hT细胞系持续表达hTERT、CD31、CD34和von Willebrand factor,并能摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)。SUVEC-ST细胞系持续表达SV40 LT、CD31和CD34,并能摄取Dil-Ac-LDL。两个细胞系均保持正常的核型并对CSFV敏感。结果表明通过表达外源的hTERT或SV40 LT,SUVEC已被永生化,并且保留了血管内皮细胞的主要生物学特征。

端粒酶催化亚基hTRTmRNA在口腔鳞癌中的表达

目的:探讨口腔鳞癌中端粒酶催化亚基hTRTmRNA的表达。方法:应用原位杂交方法,检测hTRTmRNA在65例口腔鳞癌、25例上皮异常增生及20例正常口腔黏膜中的表达。以地高辛标记,常规杂交后处理。阳性对照为口腔鳞癌,阴性对照为不加探针。采用SPSS10.0统计软件进行χ2检验、Kendall相关分析以及成组比较t检验。结果:hTRTmRNA在正常口腔黏膜上皮组织中呈弱表达(4/20、20.0%),在上皮异常增生组织中表达增强(11/25、44.0%),在口腔鳞癌组织中呈强阳性表达(54/65、83.1%)。hTRTmRNA在口腔鳞癌组织与其他各组阳性表达率差异有统计学意义(P<0.01),并呈正相关关系(P<0.01),但正常口腔黏膜与上皮异常增生间差异无统计学意义(P>0.05);各病理类型间,染色强度构成比差异有统计学意义(P<0.01),但正常口腔黏膜与上皮异常增生间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:hTRTmRNA的表达与口腔黏膜细胞的恶性转化密切相关,端粒酶基因的重新激活,可能在口腔鳞癌的发生中起着关键作用。

人端粒酶催化亚基基因启动子调控的表达载体的构建

目的:构建人端粒酶催化亚基(humantelomerase reversetranscriptase,hTERT)基因的核心启动子调控的荧光素酶报告载体,检测其在肿瘤细胞及正常细胞中表达的差异。方法:提取人HeLa细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因的核心启动子。将其插入荧光素酶报告载体中,经SacI和HindIII酶切和PCR鉴定后,转染肿瘤细胞及正常细胞,观察两种细胞中荧光素酶基因表达的差异。结果:hTERT基因的启动子调控的表达载体在肿瘤细胞中呈高效表达;而在正常细胞中的表达极低。结论:hTERT基因的启动子具有肿瘤特异性,有可能解决肿瘤基因治疗中的靶向性问题。

人喉癌细胞端粒酶催化亚基cDNA片段的扩增与克隆

目的 :测定人喉鳞状上皮癌 hep- 2细胞的端粒酶活性水平并获得 hep- 2细胞中 h TERT c DNA片段的克隆。方法 :采用 TRAP- ELISA法测定酶活性水平 ,RT- PCR技术扩增获得目的片段。利用酶切法、PCR法和序列分析法对所获克隆进行检测。结果 :hep- 2细胞具有较高的端粒酶活性水平 ,获得含h TERT c DNA片段的克隆。结论 :利用 RT- PCR法能够从具有较高端粒酶活性水平的 hep- 2细胞中扩增获得 h TERT c

大肠癌端粒酶活性的意义及其与人端粒酶催化亚基表达的相关性

目的 :研究大肠癌组织中端粒酶活性在大肠癌发生发展中的作用及其与人端粒酶催化亚基 (h TERT)表达的相关性。方法 :运用 PCR- TRAP- EL ISA及免疫组织化学方法 (免疫组化法 )对 30例大肠癌及相应的癌旁组织、正常大肠组织及 2 0例大肠腺瘤性息肉组织中端粒酶活性和 h TERT表达进行检测。结果 :1端粒酶在大肠癌组织中的阳性表达明显高于癌旁组织、正常大肠黏膜及大肠腺瘤性息肉 (P<0 .0 5 ) ;2大肠癌组织端粒酶与淋巴结转移关系密切 ,伴淋巴结转移大肠癌端粒酶阳性表达率明显高于无淋巴结转移者 (P <0 .0 1 ) ;3相关分析显示端粒酶活性与 h TERT表达存在相关性 (P <0 .0 5 )。结论 :端粒酶在大肠癌的发生发展过程中可能起着重要作用 ,h

卵巢肿瘤端粒酶活性及其催化亚基hTERT mRNA表达的相关性研究

目的:研究端粒酶激活及其催化亚基的表达在卵巢肿瘤的发生、发展中的意义。方法:采用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附法(Trap-ELISA)及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定端粒酶活性并观察hTERT mRNA表达。结果:3株卵巢癌细胞系端粒酶活性均呈高水平表达,同时hTERT mRNA亦呈高表达;端粒酶阳性率在癌、交界性卵巢肿瘤中分别为74.19％、2/4,在良性及正常卵巢组织中未检测出活性。各组间有显著性差异(P<0.01)。hTERT mRNA仅卵巢癌中表达,阳性率为61.79％;端粒酶阳性率及hTERTmRNA表达率均随手术分期的增高而增高(P<0.01)、卵巢肿瘤端粒酶阳性率及hTERT mRNA表达率呈正相关。结论:端粒酶的激活及其催化亚基的表达与卵巢癌的发生和进展密切相关,二者有望成为卵巢癌预后判断的新指标及基因治疗的新靶点。

端粒、端粒酶及端粒酶催化亚基在大肠癌中的作用

目的:探讨端粒、端粒酶活性及端粒酶催化亚基蛋白(hTERT)在大肠癌发生发展、侵袭转移中的作用。方法:应用Southern blot、端粒重复序列扩增(TRAP)和免疫组织化学方法检测端粒长度(terminal restrictionfragments,TRFs)、端粒酶活性及hTERT表达水平。结果:大肠癌TRFs明显缩短,且随大肠癌Dukes分期的进展进一步缩短;端粒酶活性及hTERT在大肠癌组织中的阳性表达率分别为83.33%及76.67%,显著高于其他组织(P<0.05);大肠癌组织端粒酶与淋巴结转移关系密切,伴淋巴结转移大肠癌组织中的端粒酶活性及hTERT阳性表达率为80%和70%,显著高于无淋巴结转移者的0%和5%(P<0.05);相关分析显示端粒酶活性与hTERT蛋白表达存在显著相关性(P<0.05)。结论:端粒的短缩及端粒酶的活化与大肠癌的发生发展密切相关,hTERT的表达对端粒酶的激活可能起着重要作用。

胃癌组织端粒酶活性与催化亚基hTERT表达的关系

目的 :研究胃癌、胃黏膜肠化生及正常黏膜组织端粒酶活性与人端粒酶催化亚基 (hTERT)表达的相关性及端粒酶激活在胃癌发生中的作用。方法 :通过端粒重复序列扩增 (TRAP)和逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法测定 3种胃癌细胞株、2 6例胃癌、1 0例胃黏膜肠化生和 36例正常胃黏膜组织标本端粒酶活性和hTERT表达。结果 :3种胃癌细胞株、2 4例胃癌组织有端粒酶活性 ;4例肠化生端粒酶活性较弱 ;36例正常胃黏膜标本未测到端粒酶活性。hTERT在 2 6例胃癌组织、5例肠化胃黏膜中表达 ;正常胃黏膜无表达。端粒酶活性、hTERT表达与肿瘤的分期和病理分级无关。结论 :hTERT在肿瘤形成的早期阶段表达 ,端粒酶的激活是胃癌形成的关键步骤。

人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

背景:人端粒酶催化亚基与c-myc在喉鳞状细胞癌中有密切的相关性。目的:构建含有c-myc启动子的人端粒酶催化亚基的重组腺病毒载体,观察人端粒酶催化亚基在细胞中表达后对细胞增长的影响。方法:按照人工合成中反向转录的方法设计基因合成引物,用复式PCR获得目的片段ashTERT(322bp)。将片段ashTERT克隆到pUC57(2.7kb)克隆载体,然后热激转化到E.coli感受态细胞中,菌检、PCR、鉴定阳性克隆后,菌液放大培养,提取质粒pUC57-ashTERT,然后对质粒进行测序。将目的基因片段亚克隆到穿梭载体pshuttle-CMVneo上,然后构建重组腺病毒质粒pAd-ashTERT。转入293细胞中进行病毒包装、鉴定和滴度测定。结果与结论:提取质粒pUC57-ashTERT,测序符合序列要求。质粒pUC57-ashTERT转入293细胞后,成功构建了有较强感染能力的含人端粒酶催化亚基基因的重组腺病毒载体。

外源性端粒酶催化亚基不影响人骨髓间充质干细胞的特性

目的研究稳定表达端粒酶催化亚基的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)生物学特性。方法用含有人端粒酶返转录酶(hTERT)基因的反转录病毒质粒pBabepuro-hTERT感染hBMSCs,经嘌呤霉素(puro)筛选出转基因细胞,我们将其命名为hTERT-hBMSCs。采用TRAP-ELISA法检测hBMSCs细胞转染前后端粒酶活性的变化;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,染色体核型分析,测量平板克隆形成率,成骨诱导等方法对hTERT-hBMSCs细胞生物学特性进行分析。结果TRAP-ELISA法检测转染hTERT的hBMSCs的端粒酶为阳性;hTERT-hBMSCs细胞表面抗原CD44表达阳性,CD34阴性;hTERT-hBMSCs比hBMSCs增殖活跃,目前已传了11代,尚未见衰老迹象,其染色体数目和结构正常,未见畸变;克隆形成率较低,为正常细胞;并保持干细胞成骨分化潜能。结论将外源性hTERT基因转入hBMSCs后,不影响其生物学特性和分化功能。

人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞向永生化细胞的转变

背景：颅神经嵴干细胞可以作为颌面部各种组织和器官分化研究的重要细胞来源，如何使其获得永生化具有重要意义。人类细胞自发永生化的频率非常低，而一些永生化的基因可以显著增加这种频率。目的：观察人端粒酶催化亚基基因在大鼠颅神经嵴干细胞永生化过程中的作用。设计、时间及地点：观察性实验，于2007—09／2008-06在解放军第四军医大学完成。材料：选择清洁级孕8．5dSD大鼠3只，6周，体质量180g；先天性细胞免疫缺陷动物雄性Balb／c裸小鼠，体质量18～21g，均由解放军第四军医大学实验动物中心提供。质粒PCIneo-hTERT由解放军第四军医大学口腔医院牙体牙髓科提供。方法：原代培养大鼠颅神经嵴干细胞后，将含有人端粒酶催化亚基基因的质粒PCIneo-hTERT转入大鼠颅神经嵴干细胞。经G418筛选后扩增，并连续培养。采用免疫细胞化学法观察转染细胞内人端粒酶催化亚基基因和颅神经嵴干细胞的特异标志物P75的表达，检测细胞的端粒酶活性，绘制细胞生长曲线观察其增殖能力，并通过裸鼠移植实验了解转染细胞的特性。主要观察指标：细胞克隆、特异性蛋白P75表达、端粒酶活性、增殖能力及致瘤性实验结果。结果：①质粒PCIneo—hTERT转染细胞后24h，有少量细胞死亡。加G418后48h，细胞逐步开始大量死亡。12d后出现抗性细胞克隆，共有3个细胞克隆生长良好。分别命名为克隆1、2、3。克隆1和克隆2经过20～25代的传代后，细胞发生衰老、死亡：而克隆3在体外长期培养条件下生长状态良好，稳定表达人端粒酶催化亚基和P75。经转染后颅神经嵴干细胞的端粒酶活性明显升高，且能持续表达。②人端粒酶催化亚基基因转染后，3个细胞克隆在初期的增殖能力较强，随后克隆1、2的增殖速度逐渐变慢，出现死亡，克隆3越过衰老期，且无致瘤性。结论：人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞后，细胞得以永生化，其表型稳定，可作为颅颌面部细胞分化和组织工程研究的种子细胞。

鸡端粒酶催化亚基活性中心结构的预测与定位

研究利用已知脊椎动物端粒酶催化亚基及其活性中心的结构,依据比较基因组学理论,通过序列比对和同源性分析,对鸡端粒酶催化亚基(chTERT)活性中心序列进行预测与定位。结果表明,chTERT活性中心序列为长1813bp,位于鸡chTERT全序列的2013～3825bp位置。chTERT活性中心的确定为今后以鸡端粒酶催化亚基为靶标的抗肿瘤研究奠定基础。

口腔鳞癌患者端粒酶催化亚基mRNA的定量检测及其意义

目的探讨端粒酶催化亚基基因(hTERTmRNA)在口腔鳞癌患者中的表达情况及其意义。方法采用实时定量PCR法(qRT-PCR)检测25例鳞癌患者口腔鳞癌组织及其切缘组织,10例正常人口腔黏膜中hTERTmRNA的表达情况并进行比较。结果口腔鳞癌组织中hTERTmRNA的表达量明显高于切缘组织和正常口腔黏膜(P<0.05),而切缘组织与正常口腔黏膜中hTERTmRNA的表达量无区别(P>0.05)。结论口腔鳞癌中hTERT高表达,口腔切缘和正常口腔黏膜中低或无表达,提示hTERTmRNA活化是口腔癌变过程中的重要事件,hTERTmRNA可以作为检测口腔鳞癌及其切缘安全范围的一个客观量化指标。

尿脱落细胞端粒酶催化亚基活性检测对早期诊断移行膀胱癌的价值

目的探讨尿脱落细胞检测端粒酶催化亚基(hTERT)早期诊断移行膀胱癌(TCC)的价值。方法用RT-PCR法分别对膀胱癌组织、正常膀胱组织及TCC和正常对照组尿脱落细胞进行hTERT检测。结果28例TCC癌组织hTERT表达呈100%阳性,正常膀胱组织25例均无阳性表达。28例TCC患者中,尿脱落细胞hTERT表达阳性率为88.1%(25/28),正常对照组尿脱落细胞hTERT表达阳性率为6.7%(2/30)。结论尿脱落细胞hTERT检测敏感性高,无创伤,可用于膀胱癌的早期诊断。