人端粒酶催化亚基基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体

为获得端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达载体用于癌症的基因治疗 ,克隆并构建了人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因启动子调控的萤光素酶报告载体 .用脂质体转染法将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞 ,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性 .hTERT启动子在所检测的 4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性 ,平均为阳性对照的 4 4 3% ;而在端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞中则无明显的转录活性 .提示hTRET启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调 。

人端粒酶催化亚基基因启动子调控的表达载体的构建

目的:构建人端粒酶催化亚基(humantelomerase reversetranscriptase,hTERT)基因的核心启动子调控的荧光素酶报告载体,检测其在肿瘤细胞及正常细胞中表达的差异。方法:提取人HeLa细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因的核心启动子。将其插入荧光素酶报告载体中,经SacI和HindIII酶切和PCR鉴定后,转染肿瘤细胞及正常细胞,观察两种细胞中荧光素酶基因表达的差异。结果:hTERT基因的启动子调控的表达载体在肿瘤细胞中呈高效表达;而在正常细胞中的表达极低。结论:hTERT基因的启动子具有肿瘤特异性,有可能解决肿瘤基因治疗中的靶向性问题。

人端粒酶催化亚基基因启动子克隆及转录活性的评价

为检测人端粒酶催化亚基(hTERT)基因启动子,克隆构建hTERT启动子(319 bp)调控的荧光素酶报告载体,用脂质体转染法将其转染肿瘤细胞和正常细胞。结果表明,hTERT启动子在所检测的4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性,平均为阳性对照的44.3%;而在端粒酶阴性的正常成纤维细胞株中则无明显的转录活性。结论:hTERT启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调,由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的靶向性基因治疗载体。

人端粒酶催化亚基hTERT基因启动子的克隆

为了确定人端粒酶催化亚基 h TERT基因的启动子结构特征 ,采用 Panhandle PCR技术 ,从正常人外周血单核细胞基因组 DNA中扩增 h TERT基因 5′端上游旁侧序列 ,结果获得了 h TERT基因翻译起始位点上游 2 0 90 bp的基因组 DNA序列。序列分析表明 h TERT基因的启动子区域缺少典型真核启动子的核心元件 ( TATA box和 CAAT box) ,但含有多个已知转录因子蛋白结合的核心序列 ,如 E box及 Sp1核心序列。提示 h TERT基因的表达可能受特殊的转录因子调控 ,这些转录因子的激活可能与癌变细胞中 h

肿瘤细胞中端粒酶催化亚基hTERT基因启动子结合因子的检测

为了研究端粒酶催化亚基hTERT基因在癌变细胞中组成型表达的调控机制 ,采用凝胶阻滞电泳 (EMSA)实验方法检测人粒系白血病细胞HL 6 0、人红系白血病细胞K5 6 2、人肺癌细胞A5 4 9、人肝癌细胞HepG2及正常人肺成纤维细胞 2BS等体外传代的肿瘤和正常二倍体细胞核提取物中与hTERT启动子核心序列结合的核因子活性。结果在 4种实验肿瘤细胞中均可检测出与hTERT基因启动子结合的核因子活性 ,而正常二倍体细胞中则不存在这种活性的核因子。实验结果提示hTERT基因启动子结合因子可能是细胞癌变过程出现的特殊基因表达调控因子 ,与端粒酶在各种肿瘤细胞中广泛重新激活有关 ,有必要进一步分离鉴定这些肿瘤特异性的转录因子 。

端粒酶催化亚基启动子调控caspase-3基因表达对瘤细胞抑制作用的研究

通过构建端粒酶催化亚基(hTERT)启动子调控caspase3基因的真核表达载体,采用RT-PCR、短时转染、MTT、流式细胞和动物实验等研究方法,探讨hTERT启动子调控caspase3基因在端粒酶阳性的瘤细胞中表达的特异性及在体内外的抑瘤作用。结果表明,hTERT启动子调控caspase3基因在端粒酶阳性的瘤细胞HepG2中明显表达,而在正常人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast,HEL)中未见表达;caspase3的表达能明显对端粒酶阳性的瘤细胞HepG2、HeLa、Glc和A549的增殖产生明显的抑制作用,抑制率为10.5%～37.9%;同时也明显诱导HepG2、HeLa、Glc和A549细胞发生凋亡,凋亡率为15.39%～35.19%;而对端粒酶阴性的正常细胞HEL没有明显的影响。动物实验结果显示,caspase3基因转染对HepG2细胞的体内生长产生了明显的抑制作用。

端粒酶催化亚基启动子调控osm基因表达对瘤细胞抑制作用的研究

为了探讨端粒酶催化亚基(hTERT)启动子调控抑瘤素(oncostatin M,osm)基因在端粒酶表达阳性的瘤细胞中的特异性及对瘤细胞和正常细胞增殖的影响,构建了phTERTosm表达载体,分别转染瘤细胞和正常细胞,用MTT法检测osm基因表达对瘤细胞和正常细胞增殖的影响。结果表明,hTERT启动子调控osm基因对端粒酶表达阳性瘤细胞HepG2、HeLa、Glc和A549的增殖有明显的抑制作用,抑制率为12.4%～46%;而对端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞没有明显的影响,提示hTERT启动子能明显限制osm的毒性作用仅在端粒酶阳性表达的瘤细胞中,而对端粒酶表达阴性细胞则无抑制作用。

端粒酶催化亚基启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗的研究进展

近年来,端粒酶是肿瘤研究领域的热点之一,是一种核糖核酸蛋白体复合物,在绝大多数恶性肿瘤细胞中呈阳性表达,而在正常体细胞中则一般为阴性。端粒酶的活性主要是受人端粒酶催化亚单位基因的转录调控,而人端粒酶催化亚单位基因的转录主要受其启动子的调控。因此,人端粒酶催化亚单位启动子介导的使抗肿瘤基因在肿瘤细胞内靶向表达的基因治疗是肿瘤基因治疗的热点。本文对此进行了综述,旨在为肿瘤的基因治疗提供新思路。

中国人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因第六内含子VNTR多态性研究(英文)

端粒酶的激活在肿瘤发生、衰老以及细胞永生化过程中起重要作用 ,端粒酶催化亚基 (hTERT)的表达是诱导端粒酶活性的限制性步骤 ,hTERT的表达受到复杂的调控。hTERT基因组全长 40kb ,包含 16个外显子及 15个内含子 ,其中 ,在第 2和第 6内含子中各存在 2个可变数目串联重复 (VNTR)多态性序列 (VNTR2 1st、VNTR2 2nd以及VNTR6 1st和VNTR6 2nd) ,在第 12内含子存在另一个单态性串联重复序列。通过对北京地区 2 10例汉族健康人群hTERT基因第 6内含子中 3 6 bpVNTR6 1st的多态性进行调查研究 ,结果在调查人群中观察到 18、2 0、2 1、2 2、2 3、2 6和 3 5次重复共 7种等位基因型以及 14种基因型。基因型频率分布符合Hardy Weinberg平衡。与韩国浦山地区调查人群类似 ,2 0、2 2及 3 5次重复为最常见的等位基因型 ,这 3种等位基因型频率占调查人群总数的 94 76%。除了3 5次重复等位基因型频率与浦山地区人群存在差异外 ,其他基因型频率差异不显著。此外 ,除了在部分重复 2 2次的等位基因型中VNTR 5′端与浦山地区人群相同外 ,其他等位基因型中 ,北京地区汉族人VNTR6 1st 5′端均存在 53bp插入片段 ,显示出不同人种VNTR6 1st周边序列的差异性。

端粒酶逆转录酶基因启动子的克隆及其转录活性的检测

端粒酶是一种依赖RNA的DNA聚合酶,催化合成端粒的DNA重复序列,并引导端粒添加到染色体的尾端,对维持染色体的长度、调节细胞增殖和凋亡起重要作用[1].正常人的体细胞中通常检测不到端粒酶的活性,而约90%的肿瘤细胞的端粒酶活性却大大增强[2].

人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导胸苷激酶基因治疗人膀胱癌的动物实验研究

目的:探讨带有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk结合无毒的环氧鸟苷(GCV)对人膀胱癌的治疗作用。方法:建立人膀胱癌细胞株253JBALB/C裸小鼠移植瘤模型,采用Ad-hTERT-HSV-tk裸鼠尾静脉注射,腹腔注射GCV治疗并观察结果。通过常规病理切片观察肿瘤破坏情况及安全性;通过TUNEL染色进一步观察肿瘤的凋亡情况,免疫组化法测定增值细胞核抗原(PCNA)。结果:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组,显示出明显的肿瘤抑制作用,其肿瘤体积、重量显著低于各对照组(P<0.05),抑瘤率明显。Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组凋亡指数高于其它各组,而增殖指数却明显低于其它各组。结论:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对裸鼠移植瘤的生长有明显抑制作用,可以靶向性转入人膀胱癌细胞,治疗效果显著。

人喉癌细胞端粒酶催化亚基cDNA片段的扩增与克隆

目的 :测定人喉鳞状上皮癌 hep- 2细胞的端粒酶活性水平并获得 hep- 2细胞中 h TERT c DNA片段的克隆。方法 :采用 TRAP- ELISA法测定酶活性水平 ,RT- PCR技术扩增获得目的片段。利用酶切法、PCR法和序列分析法对所获克隆进行检测。结果 :hep- 2细胞具有较高的端粒酶活性水平 ,获得含h TERT c DNA片段的克隆。结论 :利用 RT- PCR法能够从具有较高端粒酶活性水平的 hep- 2细胞中扩增获得 h TERT c

卵巢肿瘤端粒酶活性及其催化亚基hTERT mRNA表达的相关性研究

目的:研究端粒酶激活及其催化亚基的表达在卵巢肿瘤的发生、发展中的意义。方法:采用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附法(Trap-ELISA)及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定端粒酶活性并观察hTERT mRNA表达。结果:3株卵巢癌细胞系端粒酶活性均呈高水平表达,同时hTERT mRNA亦呈高表达;端粒酶阳性率在癌、交界性卵巢肿瘤中分别为74.19％、2/4,在良性及正常卵巢组织中未检测出活性。各组间有显著性差异(P<0.01)。hTERT mRNA仅卵巢癌中表达,阳性率为61.79％;端粒酶阳性率及hTERTmRNA表达率均随手术分期的增高而增高(P<0.01)、卵巢肿瘤端粒酶阳性率及hTERT mRNA表达率呈正相关。结论:端粒酶的激活及其催化亚基的表达与卵巢癌的发生和进展密切相关,二者有望成为卵巢癌预后判断的新指标及基因治疗的新靶点。

人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

背景:人端粒酶催化亚基与c-myc在喉鳞状细胞癌中有密切的相关性。目的:构建含有c-myc启动子的人端粒酶催化亚基的重组腺病毒载体,观察人端粒酶催化亚基在细胞中表达后对细胞增长的影响。方法:按照人工合成中反向转录的方法设计基因合成引物,用复式PCR获得目的片段ashTERT(322bp)。将片段ashTERT克隆到pUC57(2.7kb)克隆载体,然后热激转化到E.coli感受态细胞中,菌检、PCR、鉴定阳性克隆后,菌液放大培养,提取质粒pUC57-ashTERT,然后对质粒进行测序。将目的基因片段亚克隆到穿梭载体pshuttle-CMVneo上,然后构建重组腺病毒质粒pAd-ashTERT。转入293细胞中进行病毒包装、鉴定和滴度测定。结果与结论:提取质粒pUC57-ashTERT,测序符合序列要求。质粒pUC57-ashTERT转入293细胞后,成功构建了有较强感染能力的含人端粒酶催化亚基基因的重组腺病毒载体。

胃癌组织端粒酶活性与催化亚基hTERT表达的关系

目的 :研究胃癌、胃黏膜肠化生及正常黏膜组织端粒酶活性与人端粒酶催化亚基 (hTERT)表达的相关性及端粒酶激活在胃癌发生中的作用。方法 :通过端粒重复序列扩增 (TRAP)和逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法测定 3种胃癌细胞株、2 6例胃癌、1 0例胃黏膜肠化生和 36例正常胃黏膜组织标本端粒酶活性和hTERT表达。结果 :3种胃癌细胞株、2 4例胃癌组织有端粒酶活性 ;4例肠化生端粒酶活性较弱 ;36例正常胃黏膜标本未测到端粒酶活性。hTERT在 2 6例胃癌组织、5例肠化胃黏膜中表达 ;正常胃黏膜无表达。端粒酶活性、hTERT表达与肿瘤的分期和病理分级无关。结论 :hTERT在肿瘤形成的早期阶段表达 ,端粒酶的激活是胃癌形成的关键步骤。

人端粒酶逆转录酶启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗的研究进展

端粒酶与肿瘤发生发展的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一.端粒的磨耗限制大多数体细胞的复制,肿瘤细胞主要通过转录上调端粒酶限制成分催化亚基端粒酶逆转录酶(hTERT)维持端粒长度.由于hTERT启动子区域已被克隆,其特点也已被鉴定,hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗成为研究的热点.我们综述了hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗最新研究进展.

人端粒酶逆转录酶基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异性表达载体的构建

目的构建了人端粒酶逆转录酶(human telomerasereserse transcription,hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体。方法提取人SKOV3细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因核心启动子。并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达载体中。用脂质体转染法,将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞,检测肿瘤细胞和正常细胞中GFP差异表达。结果HTERT基因核心启动子调控的表达载体,在所检测的3种肿瘤细胞中均具有明显的转录活性;而在正常细胞中则无明显的转录活性。结论hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子的载体可能是一种新型和有希望肿瘤治疗的途径。

人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子在肿瘤基因治疗中的应用

目前肿瘤靶向基因治疗是肿瘤基因治疗领域中非常具有应用前景的疗法之一。大量研究表明肿瘤中端粒酶会异常表达。与常用启动子相比,人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子能够靶向端粒酶阳性细胞如肿瘤细胞等,而成为肿瘤治疗研究的热点。本文就hTERT启动子介导毒性基因、自杀基因、溶瘤病毒等进行肿瘤的基因治疗,以及hTERT启动子优化策略进行阐述。

端粒酶逆转录酶基因启动子调控FADD表达载体的构建

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控FADD的特异表达载体。方法利用PCR技术克隆hTERT基因启动子,FADD基因片段,并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达载体中。结果hTERT基因启动子调控FADD表达载体经酶切鉴定含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。结论hTRET基因启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因启动子调控FADD表达载体可能是一种新型、有希望的肿瘤治疗的途径。