影像组学结合深度学习预测异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤的端粒酶逆转录酶启动子状态

目的 探讨基于MRI的影像组学和深度学习建立融合模型预测异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤的端粒酶逆转录酶启动子(TERTp)突变状态。资料与方法 回顾性分析2019年1月—2021年6月重庆医科大学附属第一医院癌症基因组图谱和癌症影像档案的175例异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤患者(训练组122例,测试组53例),评估其TERTp突变状态。在T1c和T2f图像上勾画水肿区和肿瘤区,使用SE-Net模型构建深度学习模型,提取不同区域(水肿区、肿瘤区和整体病变)的组学特征,并通过最小绝对收缩和选择算法筛选11个特征建立组学模型。最后,将影像组学模型、深度学习模型和包含伦勃朗视觉感受图像特征的临床模型结合为融合模型,使用校准曲线和决策曲线评估模型。结果 最终建立6个预测模型,临床模型训练组和测试组曲线下面积(AUC)分别为0.815(95%CI 0.738~0.892)和0.645(95%CI 0.494~0.796);深度学习模型训练组和测试组AUC分别为0.860(95%CI 0.798~0.922)和0.735(95%CI 0.614~0.856);融合组学模型比单独水肿或肿瘤区组学模型预测性能更优,训练组和测试组AUC分别为0.906(95%CI 0.856-0.955)和0.867(95%CI 0.769~0.964);融合模型预测性能最佳,训练组和测试组AUC分别为0.964(95%CI 0.929~1.000)和0.905(95%CI 0.818~0.991)。结论 影像组学结合深度学习的临床融合模型在预测异柠檬酸脱氢酶野生型弥漫性星形细胞瘤的TERTp突变状态方面表现良好。

原发性肺腺癌患者外周血端粒酶逆转录酶阳性白细胞检测方法的建立

目的:建立一种基于端粒酶逆转录酶(TERT)活性的外周血白细胞亚群检测方法,以评估恶性肿瘤患者外周血中白细胞的增殖潜能。方法:改造的重组I型单纯疱疹病毒(HSV1-hTERTp-eGFP)能够特异性地在TERT启动子高转录活性的白细胞中复制,并表达绿色荧光蛋白(GFP),通过观察绿色荧光识别具有高增殖潜力的TERT阳性白细胞,评估机体的免疫增殖潜能。分别将100、500、1 000个经HSV1-hTERTp-eGFP病毒感染24 h后的Jurkat阳性细胞,加入到未经病毒感染的2.5×106个外周血白细胞中,作为模拟样品进行检测,设置3个平行组,并对阳性细胞的回收率、重复性、线性回归系数等指标进行检验。同时,采集5例良性肺结节患者外周血,设置3个平行组,检测每组1 mL外周血中的TERT阳性白细胞比例,通过计算组内变异系数评估外周血样本检测技术的可靠性。此外,利用本检测技术,对80例良性肺结节患者及80例原发性肺腺癌患者外周血TERT阳性白细胞百分比进行检测和分析。结果:Jurkat细胞系能够被HSV1-hTERTp-eGFP病毒感染并启动GFP的表达,可以作为模拟样本进行技术验证。100、500、1 000个Jurkat细胞的模拟样品平均检出阳性细胞数分别为80.3、448.2、920.6个,回收率分别为80.3%、89.6%和92.1%;3次重复实验的批间变异系数分别为11.3%、7.2%、4.4%,而3个平行实验组内的批内变异系数均小于10%;5例良性肺结节患者外周血TERT阳性细胞百分比的组内变异系数也均在10%以内。说明本检测技术准确度高,且具有良好的稳定性。在80例良性肺结节患者中,随着年龄的增长,TERT阳性白细胞的百分比呈下降趋势(r=-0.61;P<0.01)。与良性肺结节患者对照组相比,早期肺腺癌患者的TERT阳性白细胞百分比降低(P<0.01);与非浸润性肺腺癌患者相比,浸润性肺腺癌患者的TERT阳性白细胞的比例显著降低(P<0.01)。结论:肺腺癌患者的外周血存在免疫细胞增殖能力下降的现象,且在浸润性肺腺癌患者中表现更明显。这一发现可能与年龄相关的免疫衰老有密切联系,为理解浸润性肺腺癌患者较差的预后提供了新视角,并为深入探索免疫衰老机制指明了方向。

靶向端粒酶逆转录酶基因siRNA抑制兔早期后发性白内障的实验研究

目的观察靶向端粒酶逆转录酶(TERT)基因小干扰RNA(siRNA)对兔眼白内障术后早期晶状体后囊膜混浊的抑制作用。方法选取20只新西兰大白兔(40眼)纳入研究,采用自身对照法,分为2组:右眼为靶向TERT基因siRNA重组腺病毒TERT-siRNA-Adv组(实验组),左眼为阴性对照重组腺病毒Adv组(对照组),每组20眼;均实施超声乳化晶状体吸除术,术后前房内分别注入0.1 mL滴度为10^(9) PFU/mL的TERT-siRNA-Adv和阴性对照腺病毒;术后第1天、1周、2周、4周观察眼压、角膜水肿、前房闪辉及后发性白内障(PCO)分级情况,术后4周对术眼各组织行病理学检查及采用Western印迹法检测后囊膜细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化。结果实验组后囊膜混浊较对照组明显减轻(P<0.05);术后早期存在轻度眼压升高以及眼前节炎症反应(角膜水肿、前房闪辉),但于术后1周恢复,2组间差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,实验组后囊膜细胞内α-SMA相对表达量明显下降(P<0.05);组织病理学结果显示,实验组后囊膜下少量成纤维细胞增殖,对照组后囊膜下多层成纤维细胞增殖,囊膜结构紊乱;2组角膜、虹膜各层组织细胞排列整齐,结构完整,无明显炎性细胞浸润。结论靶向TERT基因siRNA可有效抑制晶状体上皮细胞增殖以及兔早期PCO的发生,且对眼前段各组织无明显毒性作用。

新疆维吾尔族妇女子宫颈鳞状细胞癌中人乳头瘤病毒16感染和p33^(ING1b)及端粒酶逆转录酶催化亚单位表达的相关性

目的探讨新疆维吾尔族妇女子宫颈鳞状细胞癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)16感染和p33ING1b及端粒酶逆转录酶催化亚单位(hTERT)表达的相关性。方法采用免疫组织化学方法检测了50例子宫颈鳞状细胞癌(SCC)和34例子宫颈上皮内瘤变(CIN)p33ING1b和hTERT表达情况,PCR法检测HPV16感染情况,并与12例正常子宫颈进行对照。结果对照组、CIN1组、CIN2～3组和SCC组中HPV16感染率分别为0、22.2%、44.0%和74.0%,各组间差异有显著性(x2=26.537,P=0.000);p33ING1b阳性率分别为91.7%、77.7%、68.0%和36.0%,各组间差异有显著性(x2=38.943,P=0.000);hTERT阳性率分别为50.0%、66.6%、88.0%和94.0%,各组间差异也有显著性(x2=48.199,P=0.000)。HPV16感染与p33ING1b表达呈负相关(r=-0.294,P=0.004),与hTERT表达呈正相关(r=0.286,P=0.005);p33ING1b表达与hTERT表达呈负相关(r=-0.361,P=0.000)。结论HPV16感染可能与新疆维吾尔族妇女子宫颈SCC组织中p33ING1b表达下降及hTERT表达增加有关。

染氟大鼠血清雌二醇水平与生精细胞端粒酶逆转录酶表达关系的研究

目的了解氟中毒大鼠雌激素水平与生精细胞端粒酶表达的关系。方法将30只雄性SD大鼠随机分为对照组、低剂量染毒组、高剂量染毒组,分别按0、10和20mg/kg体重的染毒剂量隔日腹腔注射氟化钠(NaF)溶液39天后,用放射免疫法测定大鼠血清中雌二醇含量,用原位杂交法检测端粒酶逆转录酶(TERT)表达情况。同时镜检成熟精子质量和睾丸组织病理学改变。结果染毒各组大鼠血清雌二醇含量低于对照组(P<0·05);且随着染毒剂量的增加,雌二醇含量逐渐降低。染毒各组大鼠生精细胞TERT阳性表达率分别低于对照组(P<0·05);且随着染毒剂量的增加,TERT阳性表达率逐渐降低。各染毒组大鼠精子数量和精子存活率低于对照组(P<0·05);精子畸形率高于对照组(P<0·05);随着染毒剂量的增加,精子数量、精子存活率降低(P<0·05),精子畸形率升高(P<0·05)。各染毒组大鼠血清雌二醇含量与生精细胞TERT表达率均呈正相关,低剂量染毒组r=0·941,P<0·01;高剂量染毒组r=0·929,P<0·01。结论NaF很可能是通过雌激素/雌激素受体-端粒酶逆转录酶-精子途径对生殖系统造成损害的,各染毒组大鼠血清雌激素含量与生精细胞TERT表达率呈显著正相关。

c-myc调节人端粒酶逆转录酶(htert)启动子活性的体外研究

目的 :研究c myc对人端粒酶逆转录酶 (htert)启动子的调节作用。方法 :采用Lipofect脂质体转染法将DNA质粒分别转染至肝癌细胞HepG2 、猴肾COS 7细胞和NIH3T3细胞 ,孵育 48h后 ,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果 :与对照相比 ,载有htert 80 0bp启动子的质粒TERTLuc(80 0 )在肿瘤细胞HepG2 中活性显著增强。外源性转录因子c myc可显著上调htert启动子的表达 ,其激活作用与剂量呈正相关。人工突变c myc结合位点明显降低htert启动子的活性。结论 :c myc可直接激活htert启动子的表达 ,是调节端粒酶活性的重要转录因子。

CD_(34)^+儿童急性淋巴细胞白血病人类端粒酶逆转录酶基因表达的研究

目的探讨人类端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)基因表达与CD34+儿童急性淋巴细胞白血病的关系和临床意义。方法采集42例ALL患儿骨髓标本,分别进行细胞形态学及细胞化学染色,确定其FAB类型,运用一组相关的单克隆抗体,采用流式细胞术及直接免疫荧光标记技术进行免疫分型,采用吉姆萨G显带技术进行核型分析;同时,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测其外周血hTERT表达水平。结果儿童急性淋巴细胞白血病CD34+表达阳性率52.38%(22/42),CD34+髓系抗原表达阳性率高CD34-;CD34+的ALLhTERT-mRNA表达水平高于CD34-的ALL,而正常对照组无或低表达。结论CD34+儿童急性淋巴细胞白血病hTERT-mRNA表达上调;hTERT基因表达参与了儿童急性淋巴细胞白血病的发生发展。

苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对人端粒酶逆转录酶表达的影响

目的观察苦参碱诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达的影响。方法以终质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL的苦参碱作用肺腺癌A549细胞48 h后,通过台盼蓝拒染法计数细胞的生长抑制率;以终质量浓度为0.2 mg/mL的苦参碱作用A549细胞48、72、96 h后,经透射电镜和DNA Ladder实验了解到细胞凋亡的发生,PCR-TRAP法检测端粒酶活性,实时RT-PCR检测hTERT的mRNA表达水平。结果各种质量浓度的苦参碱作用A549细胞48 h后,均显著抑制细胞的增殖且呈浓度依赖性;0.2 mg/mL的苦参碱作用A549细胞不同时间后,经透射电镜形态学检测和DNA Ladder实验,均显示A549细胞发生了凋亡改变;0.2 mg/mL的苦参碱作用A549细胞48 h后,端粒酶活性明显受抑,hTERT mRNA表达显著降低。结论苦参碱能抑制肺腺癌A549细胞的生长并诱导其凋亡,其机制可能与下调hTERT基因表达,抑制端粒酶活性,破坏端粒稳定性有关。

人端粒酶逆转录酶真核表达质粒转染人成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

目的 分析人端粒酶逆转录酶 (h TERT)真核表达质粒 p GRN14 5转染人成纤维细胞的生物学特性。方法 体外分离培养小儿包皮成纤维细胞 ,脂质体法将构建的 p GRN14 5转染人成纤维细胞 ,经潮霉素 B筛选 ,扩增培养阳性克隆。 RT- PCR法、TRAP- PCR法分析细胞端粒酶活性。流式细胞术检测细胞增殖周期及细胞凋亡率 ,对转染后细胞行染色体核型分析及免疫组织化学法检测胶原分泌能力。结果 转染后培养的人成纤维细胞形态与转染前相比无明显改变 ,转染细胞稳定地表达端粒酶活性 ,流式细胞术分析转染前后成纤维细胞的增殖周期无明显改变 ,细胞凋亡率较转染前降低。经 p GRN14 5转染的人成纤维细胞保持正常的二倍体核型 ,具有正常分泌 、 型胶原的能力。结论 p GRN14 5转染的人成纤维细胞稳定地表达端粒酶活性 ,细胞寿命明显延长。

外源性人端粒酶逆转录酶基因转染对正常人毛乳头细胞的影响

目的研究外源性人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因转染对体外培养正常人毛乳头细胞的影响。方法采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养。检测转染细胞内hTERT基因的整合和表达情况,初步分析转染细胞的生物学特性。结果转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,传代次数增加,已连续传至35代。检测证实转染细胞内hTERT基因在DNA、mRNA和蛋白质水平均有表达,且此转染细胞具有体外培养正常毛乳头细胞的生物学特性。结论外源性hTERT基因转染可以延长体外培养正常人毛乳头细胞的寿命且可保持其正常的生物学特性。

端粒酶逆转录酶与血管内皮细胞生长因子在前列腺癌中的表达及其相关性的研究

目的:探讨端粒酶逆转录酶(TRT)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)在前列腺癌(PCa)中的表达及两者的相关性。方法:应用免疫组化染色(SP)法结合计算机辅助图像分析方法,对30例病理证实为PCa和30例良性前列腺增生(BPH)穿刺标本中的TRT、VEGF的表达进行半定量分析。结果:30例PCa标本中,TRT、VEGF阳性表达率分别是63.3%(19/30)和76.7%(23/30);30例BPH标本中,TRT、VEGF阳性表达率分别是16.7%(5/30)和46.7%(14/30),组间差异均有显著性意义(P<0.05)。TRT与VEGF的表达显著相关(r=0.833 3,P<0.05)。结论:TRT、VEGF的表达可能是PCa的恶性表型,两者的表达具有显著相关性,但其确切机制还需深入研究。

细胞因子诱导人脐血间充质干细胞分化过程中细胞巢蛋白、神经丝亚单位和端粒酶逆转录酶mRNA的表达

目的:观察细胞因子EGF和bFGF联合诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化过程中细胞 巢蛋白(nestin)、神经丝亚单位M(NF M)和端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的变化。方法:采集健康自然分娩产 妇脐血,密度梯度离心分离单个核细胞(MNCs),PBS洗涤2次后重悬于含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12 中,接种于T 75培养瓶内(细胞密度为1×106ml-1),一组加入细胞因子EGF和bFGF,终浓度各为10μg/L,另一 组不加细胞因子,剩余细胞用液氮冻存。培养24h倾去全部液体以除去未贴壁细胞,以后每3d全量换液1次,倒 置显微镜下观察细胞形态。分别收集培养1d、4d、7d、14d贴壁细胞和冻存细胞,采用RT -PCR方法检测nestin、 NF M、hTERTmRNA的表达。结果:未培养的脐血MNCs(内含MSCs)nestin、NF M、hTERTmRNA均表达阳性。培 养后nestin、hTERTmRNA表达下降,至第7d已不能检出;而NF MmRNA的表达随培养时间延长而增强。与对照 组相比,细胞因子组NF MmRNA表达较高,nestin、hTERTmRNA表达的下降趋势延迟。结论:细胞因子EGF和 bFGF在联合诱导脐血MSCs分化为神经细胞的过程中,能下调hTERTmRNA的表达。

RNAi靶向人端粒酶逆转录酶对人肝癌细胞的生长抑制作用

目的利用RNAi技术降低人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达,抑制其活性,研究其对人肝癌细胞的增殖和凋亡影响。方法构建针对hTERT基因的siRNA真核表达载体pLXSN-EGFP-U6-siTERT,制备靶向hTERT的重组逆转录病毒;用重组逆转录病毒感染HepG2人肝癌细胞,以TRAP法检测端粒酶活性变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;MTT法检测肿瘤细胞生长抑制情况。结果成功制备出hTERTsiRNA逆转录病毒表达载体;重组病毒感染HepG2细胞24、48、72h后端粒酶活性分别下降了23.84%、58.03%和85.01%(P<0.05);感染后24h细胞凋亡率29.05%;MTT实验结果显示肿瘤生长受到抑制,并存在一定量效和时效关系。结论hTERTsiRNA能特异性使hTERT基因表达抑制,端粒酶活性下降,肝癌细胞增殖受到抑制。

人端粒酶逆转录酶慢病毒载体的构建及人肝细胞的初步筛选

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)慢病毒表达载体,将其转染人肝细胞L02并且通过杀稻瘟筛选出阳性克隆细胞。方法:以PBABE-puro-hTERT质粒为模板PCR法获取目的基因attB1-hTERT-attB2,通过BP反应克隆至pDONR221;采用LR重组酶将pDONR221-hTERT和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5-DEST-hTERT。将重组载体pLenti6/V5-DEST-hTERT与包装质粒充分混合,利用脂质体共转染293FT细胞,获得重组慢病毒颗粒。将其感染人肝细胞L02,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆。结果:测序发现入门载体pDONR221包含的目的基因hTERT 1547位点存在点突变(原碱基A变成G),通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT成功构建。重组慢病毒滴度为1×108TU/L,获得20株稳定抗性的单克隆细胞。结论:成功构建人端粒酶逆转录酶的慢病毒表达载体,获得稳定抗性的单克隆肝细胞,为进一步建立永生化肝细胞系奠定了基础。

人端粒酶逆转录酶与bcl-2在成釉细胞瘤中的表达

目的 研究成釉细胞瘤 (AB)中人端粒酶逆转录酶 (hTERT)和bcl_2的表达。方法 采用原位杂交或免疫组化方法对AB(分原发、复发和恶变组 )中hTERTmRNA和bcl_2进行检测 ,并与正常口腔黏膜作对照。结果 hTERTmRNA阳性表达率在AB中为 94 4 % ,正常口腔黏膜中为 14 3% (P <0 0 0 1) ;bcl_2蛋白阳性率在AB中为88 0 % ,正常口腔黏膜中为 4 4 4 % (P <0 0 0 1)。从表达趋势看伴随着AB的复发与恶变 ,hTERTmRNA与bcl_2表达均增强 (P <0 0 5 )。结论 端粒酶和bcl_2可作为评价AB预后的有效指标。端粒酶的活化和bcl_2表达的增强在AB的发生、发展中起着重要作用。

急性白血病端粒酶活性、端粒酶逆转录酶和c-myc的表达及其相互间的关系

背景与目的:研究表明端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscriptase,hTERT)表达的调控对端粒酶的活性起着决定性的作用,而c-myc对hTERT表达又起调控作用。本研究拟对急性白血病的端粒酶活性、hTERT、c-myc表达及它们之间的关系进行探讨。方法:应用PCR-FLISA半定量法对35例急性初治白血病患者及15例对照者的骨髓单个核细胞(mononuclear cell,MNC)进行端粒酶活性检测,同时用RT-PCR法对其进行hTERT及c-myc癌基因mRNA的表达检测。结果:急性初治白血病患者端粒酶活性、hTERT及c-myc mRNA表达水平分别为0.71±0.32、0.47±0.36及0.85±0.31,与对照组比较其差异均具有显著性(P<0.01)。端粒酶活性及c-myc mRNA的表达与hTERT mRNA的表达存在正相关(等级相关系数分别为0.36和0.29,P<0.01)。在25例随访的病例中,缓解者平均端粒 酶活性及hTERT表达水平分别为0.61±0.39、0.29±0.31,未缓解者的平均端粒酶活性及hTERT表达水平分别为0.83±0.23、0.53±0.31,两组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:急性初治白血病患者端粒酶活性、hTERT及c-myc mRNA表达升高。

槟榔碱对口腔角质形成细胞端粒酶逆转录酶表达的影响

目的:观察槟榔碱对人口腔角质形成细胞(KC)端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA及蛋白表达的影响,进一步探讨hTERT在口腔黏膜下纤维性变(OSF)癌变过程中的作用机制。方法:体外培养正常口腔黏膜的上皮细胞,将实验细胞分为0.03、0.06、0.09g/L槟榔碱组、空白对照组。采用Western印迹法和RT-PCR方法观察槟榔碱对KChTERTmRNA及蛋白表达的影响。结果:槟榔碱能呈剂量依赖性增加KChTERTmRNA及蛋白表达,0.03、0.06、0.09g/L槟榔碱组hTERTmRNA及蛋白表达均高于空白对照组(P<0.05)。结论:槟榔碱对KChTERTmRNA与蛋白表达有明显诱导作用,且在一定范围内呈剂量依赖关系,槟榔碱诱导KChTERT过度表达可能在OSF癌变过程中起重要作用。

DNA去甲基化对肝细胞人端粒酶逆转录酶上调的研究

目的:观察肝细胞系L02及肝癌细胞系SMMC-7721中人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的表达与DNA甲基化修饰之间的相关性,观察5-杂氮胞苷(5'-aza-dC)去甲基化对肝细胞系hTERT表达和端粒酶活性的影响。方法:应用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)分析肝细胞系L02和肝癌细胞SMMC-7721中hTERT的甲基化状态,采用RT-PCR和TRAP-ELISA法检测5'-aza-dC干预对培养细胞hTERT mRNA表达及端粒酶活性的影响。结果:肝细胞系L02中hTERT有甲基化修饰,5'-aza-dC去甲基化处理上调hTERT mRNA表达并呈现端粒酶活性升高;肝癌细胞系SMMC-7721中hTERT则没有甲基化修饰,5'-aza-dC去甲基化处理对其hTERT表达和端粒酶活性无影响。结论:肝细胞中DNA甲基化可能参与抑制肝细胞hTERT的表达,hTERT去甲基化可能是肝癌发生发展的重要机制之一。