人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导胸苷激酶基因治疗人膀胱癌的动物实验研究

目的:探讨带有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk结合无毒的环氧鸟苷(GCV)对人膀胱癌的治疗作用。方法:建立人膀胱癌细胞株253JBALB/C裸小鼠移植瘤模型,采用Ad-hTERT-HSV-tk裸鼠尾静脉注射,腹腔注射GCV治疗并观察结果。通过常规病理切片观察肿瘤破坏情况及安全性;通过TUNEL染色进一步观察肿瘤的凋亡情况,免疫组化法测定增值细胞核抗原(PCNA)。结果:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组,显示出明显的肿瘤抑制作用,其肿瘤体积、重量显著低于各对照组(P<0.05),抑瘤率明显。Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组凋亡指数高于其它各组,而增殖指数却明显低于其它各组。结论:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对裸鼠移植瘤的生长有明显抑制作用,可以靶向性转入人膀胱癌细胞,治疗效果显著。

人端粒酶逆转录酶启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗的研究进展

端粒酶与肿瘤发生发展的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一.端粒的磨耗限制大多数体细胞的复制,肿瘤细胞主要通过转录上调端粒酶限制成分催化亚基端粒酶逆转录酶(hTERT)维持端粒长度.由于hTERT启动子区域已被克隆,其特点也已被鉴定,hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗成为研究的热点.我们综述了hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗最新研究进展.

人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子在肿瘤基因治疗中的应用

目前肿瘤靶向基因治疗是肿瘤基因治疗领域中非常具有应用前景的疗法之一。大量研究表明肿瘤中端粒酶会异常表达。与常用启动子相比,人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子能够靶向端粒酶阳性细胞如肿瘤细胞等,而成为肿瘤治疗研究的热点。本文就hTERT启动子介导毒性基因、自杀基因、溶瘤病毒等进行肿瘤的基因治疗,以及hTERT启动子优化策略进行阐述。

端粒及端粒酶逆转录酶基因与慢性阻塞性肺疾病相关性的研究进展

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种多因素疾病,其主要危险因素是烟雾暴露和衰老。既往研究证明,端粒过度缩短作为COPD患者加速衰老的标志,在COPD的发生、发展中发挥重要作用。在参与COPD发病的氧化应激、炎症反应过程中均能发现端粒的缩短。端粒酶逆转录酶是决定端粒长度的关键因素,其基因突变、缺失及单核苷酸多态性也被证明与COPD的不良临床结局密切相关。本文通过对端粒及端粒酶逆转录酶基因与COPD相关性的研究进展进行综述,旨在为临床提供依据。

重组腺相关病毒介导人端粒酶逆转录酶基因转染对人髓核细胞功能的影响

目的:研究重组腺相关病毒介导人端粒酶逆转录酶基因(recombinant adenoassociated virus vector-me-diated human telomerase reverse transcriptase,rAAV-hTERT)转染对体外培养人髓核细胞功能的影响。方法:利用机械与酶消化的方法获得均一性的人椎间盘髓核细胞,将构建好的rAAV-hTERT转染P2代体外单层培养的髓核细胞。用重组腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白(recombinant adenoassociated virus vector-mediatedenhanced green fluorescent protein,rAAV-EGFP)作为标记基因观察细胞转染效率,按感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)103、104、105病毒基因组拷贝数/细胞(vector genomes/cell,v.g/cell)设组,流式细胞仪检测,筛选病毒转染的最佳MOI;设立rAAV-hTERT转染组、AAV空病毒转染组及空白细胞对照组,用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reareaction,RT-PCR)及免疫印迹(Western-blot)方法检测rAAV-hTERT转染后hTERT基因在髓核细胞内的表达,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)及酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent,ELISA)检测髓核细胞合成Ⅱ型胶原及蛋白多糖能力的变化。结果:rAAV-EGFP转染细胞后第7天时,MOI为105v.g/cell组转染效率可达73.9%,明显高于MOI 103、104v.g/cell组(P<0.05);rAAV-hTERT转染组在转染后的第7、60、90、120天均可检测到hTERT基因的表达,而其他两组则无表达;转染rAAV-hTERT后120d之前,rAAV-hTERT转染组分泌蛋白多糖及Ⅱ型胶原较其他两组均明显增高(P<0.05),而两对照组之间则始终无明显差异(P>0.05)。结论:rAAV-hTERT能成功转染人椎间盘髓核细胞并正确表达,rAAV-hTERT转染能有效延长髓核细胞分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖功能。

p53基因对HL-60细胞端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶基因表达的影响

为了研究野生型 p53基因转染的HL 60细胞端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因表达的变化 ,采用脂质体法将野生型 p53基因转染HL 60细胞 ,用TUNEL检测细胞凋亡 ,用端粒重复扩增法 (TRAP) 酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测端粒酶活性变化 ,以及用RT PCR方法检测hTERTmRNA表达的变化。结果显示 :转染野生型p53基因的HL 60细胞在 32 .5℃培养 2 4小时和 72小时后 ,凋亡率分别为 8.3 %和 2 1 .0 % ,hTERTmRNA和端粒酶活性分别下降至对照组的 68.4%和 55 .8%及 2 7.3 %和 8.9%。结论 :p53基因能下调HL 60细胞hTERTmRNA和端粒酶活性 。

端粒酶逆转录酶基因启动子的克隆及其转录活性的检测

端粒酶是一种依赖RNA的DNA聚合酶,催化合成端粒的DNA重复序列,并引导端粒添加到染色体的尾端,对维持染色体的长度、调节细胞增殖和凋亡起重要作用[1].正常人的体细胞中通常检测不到端粒酶的活性,而约90%的肿瘤细胞的端粒酶活性却大大增强[2].

人端粒酶逆转录酶基因沉默对肺腺癌细胞侵袭、增殖、凋亡的影响

目的:探讨靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(siRNA)转染对肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响。方法:构建靶向hTERT的siRNA表达质粒转染A549细胞,通过Western blot检测蛋白的表达水平,确定有效后,通过Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术测定转染后肿瘤细胞的细胞周期和凋亡率。结果:成功构建靶向hTERT的siRNA表达质粒。实验组siRNA转染后的细胞侵袭能力较对照组减弱(P<0.01),生长抑制率明显高于阴性对照组(P<0.01),且表现出时间依赖性。流式细胞术测定显示,实验组siRNA转染48h后,肿瘤细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论:靶向hTERT的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制增殖,诱导细胞凋亡的发生。

实时RT-PCR检测人端粒酶逆转录酶mRNA用于乳腺癌鉴别诊断及与c-Myc基因的相关性

目的探讨定量检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA在乳腺癌鉴别诊断中的价值,并观察原癌基因c-Myc与hTERT mRNA表达的关系。方法收集癌旁正常乳腺组织、乳腺普通型导管增生、不典型导管增生、导管原位癌、浸润性导管癌病例,采用实时荧光定量RT-PCR技术(Real-ti me RT-PCR)定量检测hTERT和c-Myc基因的转录水平。结果以NhTERT=10为临界值,所有正常组织和良性病变NhTERT值均小于临界值,而hTERT基因转录升高的导管原位癌及浸润性导管癌其NhTERT值均大于此临界值。显示hTERT和c-Myc基因转录水平呈正相关(γ=0.7395,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR技术检测hTERT基因表达具有高敏感性和特异性,能为常规病理学诊断提供客观的参考指标,从而提高乳腺不典型导管增生与导管原位癌鉴别诊断的准确性。原癌基因c-Myc转录水平上调可能与乳腺癌hTERT基因转录激活有关。

蝎毒对人肝癌细胞Bel-7404凋亡及端粒酶逆转录酶基因的作用

目的观察蝎毒对人肝癌Bel-7404细胞增殖的影响及对端粒酶逆转录酶基因(hTERTmRNA)活性的影响。方法以人肝癌细胞株Bel-7404为研究对象,以不同浓度的蝎毒处理体外培养的人肝癌Bel-7404细胞72 h,以噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制,采用RT-PCR法检测细胞hTERTmRNA的表达情况。结果MTT结果显示蝎毒抑制Bel-7404细胞增殖、诱导细胞凋亡且抑制有浓度依赖性。同时,蝎毒可抑制hTERTmRNA的表达。结论抑制端粒酶逆转录酶基因(hTERTmRNA)表达而抑制端粒酶的活性、诱导细胞凋亡,可能是蝎毒的抗癌细胞机制之一。

端粒酶逆转录酶及c-myc基因反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性的影响

目的研究端粒酶逆转录酶(hTERT)与c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞端粒酶活性的影响,探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT和c-myc基因表达的关系。方法应用反义寡核苷酸(ASODN)分别封闭HL-60细胞hTRET与c-myc基因,RT-PCR方法检测基因表达;分别使用TRAP-ELISA法、PAGE-银染法检测细胞端粒酶活性。结果ASODN作用细胞72 h后,hTERT、c-mycmRNA的表达受到不同程度抑制,以30μmol/L作用组表达量最低。TRAP-ELISA检测:hTERT ASODN 10、20、30μmol/L作用组,c-mycASODN 20、30μmol/L作用组与未作用组比较,端粒酶活性明显降低(P<0.05);c-mycASODN 10μmol/L作用组及c-myc、hTERT SODN作用组与未作用组比较无显著差异(P>0.05)。PCR-PAGE检测:hTERT与c-mycASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol/L作用组条带最少,而同浓度hTERT ASODN作用组较c-mycASODN作用组条带减少。结论hTERT与c-myc基因ASODN能够分别抑制该基因mRNA的表达,同时具有下调端粒酶活性作用。

端粒酶逆转录酶基因hTERT在肝细胞癌中的表达及端粒酶反义基因对人肝癌细胞HepG2细胞凋亡的影响

目的:研究肝细胞癌(HCC)中端粒酶逆转录酶基因hTERT表达,探讨其在HCC发生、发展及预后复发中的意义.探讨抗端粒酶在肝细胞癌治疗中的意义.方法:采用免疫组化法检测42例HCC组织中hTERT的表达,并对hTERT与临床病理特征的关系进行分析.将反义hTR真核表达载体经脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化及致瘤性.结果:HCC中hTERT基因阳性率分别为71.4%(30/42);hTERT与在正常肝脏组织中阳性表达率0%相比,有显著性差异(P<0.01).hTERT在Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ级HCC中的表达率分别为40.0%(4/10),70.0%(14/20),100%(12/12).Ⅰ与Ⅲ级、Ⅱ与Ⅲ级比较差异显著(P<0.05).hTERT阳性表达率与患者复发有显著相关性(P<0.05).形态学观察,转染后HepG2细胞出现典型的凋亡现象.FCM检测发现G1期前出现凋亡峰.在裸鼠皮下的致瘤性明显降低.荷瘤鼠存活时间延长.结论:hTERT表达异常可能与肝脏肿瘤的发生、发展有关.检测hTERT表达可作为预测肝脏肿瘤预后复发的潜在指标.提示HCC是由多基因参与的疾病.转染端粒酶反义RNA能抑制肝癌HepG2细胞的恶性表型,促进其凋亡.

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的研究

目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。

人类端粒酶逆转录酶基因转染对足叶乙甙诱导Raji细胞凋亡的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因转入Raji细胞后足叶乙甙 (VP 16 )对细胞凋亡的影响。采用脂质体介导的转染方法将重组的hTERT基因转入Raji细胞 ,G4 18筛选 ;采用间接免疫荧光标记法及端粒酶聚合酶链反应 酶联免疫测定法检测hTERT蛋白表达水平和端粒酶活性的变化 ;姬姆萨染色及流式细胞仪观测细胞凋亡。结果发现 :转染hTERT入Raji细胞后 ,其表达hTERT的蛋白及端粒酶活性显著增加 (P <0.0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 4 8h、72h对细胞生长抑制作用不如转染空载体组及未转染组明显 (P <0 .0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 72h ,光镜下仅可见到很少量的细胞出现凋亡 ,流式细胞仪测定的细胞凋亡率 (4.34±1.0 3) %显著降低 ,分别与转染空载体组 (33.2 1± 3.12 ) %及未转染组 (31.6 3± 3.0 6 ) %比较 ,P <0.0 5。表明端粒酶活性过表达可使Raji细胞对VP

人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因腺病毒载体的构建及包装

【目的】构建能够表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的腺病毒。【方法】通过对PCI-neo-hTERT质粒的改造,依次构建出JMB293-hTERT、pAdTrack-hTERT载体,将pAdTrack-hTERT经PmeⅠ线性化后与pAdEasy-1载体共转化到BJ5183细菌中进行重组,经卡那霉素抗性筛选获得重组腺病毒载体pAdEasy-hTERT。将pAdEasy-hTERT PacⅠ酶切线性化并回收后,转染HEK293人胚肾细胞,培养7d后,收集细胞并反复冻融,收集细胞裂解液;反复扩增3次后,测定重组hTERT腺病毒的滴度。【结果】①利用酶切连接的方法得到了穿梭载体pAdTrack-hTERT;②通过同源重组将外源目的基因hTERT整合到腺病毒骨架载体中,得到重组质粒pAdEasy-hTERT;③成功获得了滴度为6.73×1010 GFU/mL的高滴度腺病毒颗粒。【结论】含有hTERT基因的重组腺病毒颗粒包装成功,为后续哺乳动物原代细胞永生化研究奠定了基础。

人端粒酶逆转录酶基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异性表达载体的构建

目的构建了人端粒酶逆转录酶(human telomerasereserse transcription,hTERT)基因核心启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体。方法提取人SKOV3细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因核心启动子。并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达载体中。用脂质体转染法,将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞,检测肿瘤细胞和正常细胞中GFP差异表达。结果HTERT基因核心启动子调控的表达载体,在所检测的3种肿瘤细胞中均具有明显的转录活性;而在正常细胞中则无明显的转录活性。结论hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子的载体可能是一种新型和有希望肿瘤治疗的途径。

甲状腺乳头状癌端粒酶逆转录酶启动子突变的临床及超声特征分析

目的:探索与端粒酶逆转录酶(TERT)启动子突变相关的特征性甲状腺乳头状癌(PTC)的超声特征。方法:选取医院收治的552例术后诊断为PTC患者,依据术后分子学检测将其分为TERT组(19例,TERT启动子突变)和BRAF基因组(533例,单纯BRAF基因突变)。根据术后病理确定淋巴结转移和脉管转移的情况,超声采集结节最大径线、结节数量、回声、边缘、成分、方位、微钙化及桥本氏甲状腺炎背景等特征。比较两组TERT启动子和BRAF基因的突变率和淋巴结转移及脉管转移的发生率;将两组有差异的临床和超声特征进行Logistic回归分析,分析与TERT启动子突变的相关危险因素。结果:552例患者平均年龄为(45.39±12.39)岁,TERT组患者的平均年龄为(57.42±12.41)岁,高于BRAF基因组患者的平均年龄(44.96±12.18)岁,差异有统计学意义(t=4.378,P<0.05),TERT组中≥45岁的患者占比(78.9%)明显高于BRAF基因组(48.2%),差异有统计学意义(x^(2)=6.931,P<0.05)。TERT组中有36.8%的患者发生侧颈区淋巴结转移,明显高于BRAF基因组(8.1%),差异有统计学意义(x^(2)=18.985,P<0.05)。TERT组的结节最大径(2.50±1.88)cm明显大于BRAF基因组的结节最大径(1.02±0.64)cm,差异有统计学意义(t=3.406,P<0.05)。TERT组>1 cm的结节占比(78.9%)明显高于BRAF基因组(32.7%),差异有统计学意义(x^(2)=17.655,P<0.05),TERT组中囊实性结节的占比(10.5%)明显高于BRAF基因组(1.1%),差异有统计学意义(x^(2)=11.351,P<0.05)。TERT组中73.7%的患者结节距离被膜<2 mm,明显高于BRAF基因组,差异有统计学意义(x^(2)=4.621,P<0.05)。Logistic回归分析显示,相对于BRAF基因组,年龄≥45岁、结节最大径>1 cm和结节成分呈囊实性是与TERT启动子突变相关的独立危险因素(OR=3.895,OR=6.442,OR=7.929;P<0.05)。结论:在结节有垂直位、微钙化、边缘不规则等恶性征象的基础上,当患者年龄≥45岁、结节>1 cm和结节成分呈囊实性时应考虑存在TERT启动子突变的可能。

端粒酶逆转录酶基因在口腔癌前病变及鳞癌的表达

目的 观察端粒酶催化蛋白基因 (h TRT)在口腔癌前病变及鳞癌中的表达 ,探讨其与口腔鳞癌(OSCC)发生发展及临床病理特征之间的关系。 方法 用原位杂交技术检测 5 4例标本 ,其中正常口腔粘膜 6例、上皮非典型增生 15例、口腔粘膜鳞癌 33例。 结果 正常口腔粘膜组织中 h TRT的 m RNA表达较弱 ,阳性信号仅局限于上皮基底层及副基底层间 ,阳性率 16 .6 7% (1/ 6 ) ;上皮非典型增生中 h TRT的 m RNA阳性表达见于多层上皮细胞 ,并随细胞异形性增高而表达增强 ,阳性率 6 0 % (9/ 15 ) ;口腔粘膜鳞癌组织中 h TRT的 m RNA有较强阳性表达 ,阳性率 87.88% (2 9/ 33) ;OSCC组织中 h TRT m RNA的表达与肿瘤临床病理分化无关 ,与淋巴结转移密切相关。 结论 端粒酶 h TRT基因的表达在

人端粒酶逆转录酶和人白细胞介素18融合基因真核表达载体的构建和功能研究

目的:以基因重组技术在真核细胞中表达人白细胞介素18(hIL-18)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)融合基因,并观察其生物学功能。方法:健康人单核细胞经RT-PCR扩增hIL-18后、T-A克隆。亚克隆至经N heⅠ、H indⅢ酶切的PCDNA 3.1(+)/hTERT中,限制性内切酶验证后,挑选出含有目标基因的正确克隆。经限制性内切酶和DNA测序分析两个基因是否已经正确连接到真核表达载体中。将hTERT/hIL-18融合基因质粒脂质体介导转染3T 3细胞中表达,经W estern-b lot验证目的基因表达产物,同时对转染细胞作免疫荧光染色。以EL ISA检测转染细胞刺激KG-1细胞分泌γ干扰素的能力,以流式细胞仪检测转染细胞抗MTX诱导凋亡的能力。结果:hTERT/hIL-18融合基因的真核表达载体PCDNA 3.1(+)构建成功,经限制性内切酶验证和DNA测序及同源性对比分析,该基因片段与NCB I基因库hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均达到99.9%;而细胞转染后经W estern-b lot验证,hTERT/hIL-18融合蛋白的分子量约127 kM r,与预期一致,荧光显微镜观察显示融合蛋白在细胞中弥散表达。此融合蛋白能刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素,并具有抗MTX诱导凋亡的生物学功能。结论:本实验构建的PCDNA 3.1(+)/hTERT-hIL-18质粒能够在真核细胞中表达,并具有生物学功能,为进一步转染树突状细胞,研制肿瘤的治疗性疫苗提供基础。

端粒酶逆转录酶基因启动子调控FADD表达载体的构建

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控FADD的特异表达载体。方法利用PCR技术克隆hTERT基因启动子,FADD基因片段,并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达载体中。结果hTERT基因启动子调控FADD表达载体经酶切鉴定含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。结论hTRET基因启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因启动子调控FADD表达载体可能是一种新型、有希望的肿瘤治疗的途径。