联用血清糖类抗原19-9和人端粒酶RNA基因检测法诊断宫颈上皮内瘤变的效果研讨

目的 :探讨联用血清糖类抗原19-9(CA19-9)和人端粒酶RNA(hT ERC)基因检测法诊断宫颈上皮内瘤变的效果。方法 :将2014年1月至2017年3月期间平凉市第三人民医院收治的283例宫颈上皮内瘤变患者作为研究对象。对这些患者均进行血清CA19-9和hT ERC基因检测。比较单用血清CA19-9检测法、hT ERC基因检测法及联用血清CA19-9和hT ERC基因检测法诊断宫颈上皮内瘤变的灵敏度。结果:检测的结果显示,与单用血清CA19-9检测法、hT ERC基因检测法诊断宫颈上皮内瘤变的灵敏度相比,联用血清CA19-9和hT ERC基因检测法诊断宫颈上皮内瘤变的灵敏度较高(P<0.05)。结论 :联用血清CA19-9和hT ERC基因检测法诊断宫颈上皮内瘤变的效果较为理想。

人乳头状瘤病毒L1壳蛋白和人端粒酶RNA基因联合检测在宫颈癌筛查中的意义

目的：探讨人乳头状瘤病毒L1壳蛋白和人端粒酶RNA基因联合检测在宫颈癌筛查中的意义。方法选取2012年10月～2014年10月新疆医科大学第一附属医院行宫颈癌筛查的患者627例，先行液基细胞学检查，后行阴道镜检查并取活检，同时行人乳头状瘤病毒L1壳蛋白检测和人端粒酶RNA基因检测。分析不同病症间临床指标的变异情况。结果未见上皮病变或恶性改变（NILM）、意义不明的不典型鳞状细胞与不典型腺细胞（ASC-US）、不除外高度鳞状上皮内病变的的不典型鳞状细胞（ASC-H）、低度鳞状上皮内病变（LSIL）、高度鳞状上皮内病变（HSIL）、鳞状细胞癌（SCC）、腺癌（AC），人乳头状瘤病毒L1壳蛋白阳性表达率分别为18.6%、42.9%、51.0%、80.6%、47.4%、5.9%、0.0%，差异有高度统计学意义（χ2=93.770，P〈0.01），呈先升高后降低趋势，在LSIL达到最高点，在AC降至最低点；人端粒酶RNA基因阳性表达率分别为0.0%、19.9%、36.3%、51.6%、94.7%、100.0%、100.0%，差异有高度统计学意义（χ2=279.564，P〈0.01），呈持续升高趋势，在SCC与AC达到最高点。依正常、炎症、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ期、CINⅡ期、CINⅢ期、宫颈癌顺序，人乳头状瘤病毒L1壳蛋白阳性表达率分别为18.6%、46.1%、80.6%、53.3%、25.0%、3.6%，差异有高度统计学意义（χ2=93.015，P〈0.01），呈先升高后降低趋势，在CINⅠ期达到最高点，在宫颈癌降至最低点；人端粒酶RNA基因阳性表达率分别为0.0%、26.4%、51.6%、93.3%、100.0%、100.0%，差异有高度统计学意义（χ2=269.582，P〈0.01），呈持续升高趋势，在CINⅢ期达到最高点。结论人乳头状瘤病毒L1壳蛋白联合人端粒酶RNA基因检测，在宫颈癌前病变中具有较高的指导价值。

人端粒酶RNA组分基因检测在宫颈病变中的应用

目的:研究宫颈脱落细胞中人端粒酶RNA组分(hTERC)基因的表达,探讨其在宫颈上皮内瘤变(CIN)及鳞状上皮细胞癌(SCC)诊断中的价值。方法:以2007年12月～2008年12月在中日友好医院行子宫颈癌筛查的138例妇女为研究对象,进行宫颈液基细胞学及组织病理学的检测,以组织病理学不同级别分组,荧光原位杂交方法检测其hTERC基因的表达。结果:病理学确诊为正常、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及子宫颈癌例数分别为20、28、31、34、25例,宫颈脱落细胞hTERC基因的扩增在不同组织病理级别中存在差别:hTERC基因扩增随细胞学级别的升高而升高,随组织病理学级别的增加而升高。结论:hTERC基因的扩增与宫颈细胞学和组织病理学级别密切相关,其扩增率随宫颈病变程度的加重而增加;检测hTERC基因的扩增,可为判断是否发展为宫颈高度病变提供依据。

正反义人端粒酶RNA组分(hTR)基因真核表达载体的构建

目的构建正义和反义端粒酶 RNA 组分((human telomeraseRNA components,hTR)基因真核表达载体.方法用 Mlu Ⅰ和 Sal Ⅰ从 pGRN83质粒上切下约579 bp 的hTR cDNA 片段,分别定向连入 pcl-neo 的 Mlu Ⅰ/Sal Ⅰ和Mlu Ⅰ/Xho Ⅰ酶切位点上,即构建成了 hTR 的正反义表达载体,并经酶切鉴定和测序确认.结果经酶切鉴定和测序证明,所构建的正反义 hTR 真核表达载体与设计完全一致.结论成功构建了人端粒酶 RNA 的正反义真核表达载体,为进一步研究正反义 hTR 基因转染对胃癌细胞端粒酶及生物学行为的影响奠定了基础.

RNA干扰hTR基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的影响

目的:探索RNA干扰(RNAi)hTR基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的影响,为膀胱尿路上皮癌基因治疗提供新的途径及依据。方法:构建以hTR基因为靶点的RNA干扰装置PhTR-siRNA,对其进行筛选和鉴定;检测PhTR-siRNA对BIU-87细胞的生物学效应,包括抑制BIU-87细胞的生长情况、端粒酶活性检测、实时定量PCR(RealTime-PCR)验证hTR变化。结果:PhTR-siRNA干扰hTR基因后膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株的生长受到抑制,明显抑制端粒酶活性,实时定量PCR验证hTR基因明显减少。结论:RNA干扰hTR基因能明显抑制膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株的生长,可作为一种膀胱尿路上皮癌的基因治疗方法。

端粒酶RNA及其催化亚单位基因hTRT在睑板腺癌中的表达

目的 探讨端粒酶RNA(hTR)及端粒酶催化亚单位基因hTRT在睑板腺癌中的表达意义。 方法 用原位杂交法检测hTR及hTRT在55例睑板腺癌、12例霰粒肿、4例睑板腺腺瘤中的表达;用EnVision法对Ki-67进行免疫组织化学染色,其结果用计算机图像自动分析系统进行量化,把积分光密度值作为肿瘤增殖指数;用SAS统计软件包对影响睑板腺癌的危险因素(性别、年龄、病程长短、肿瘤大小、肿瘤分化程度等)进行分析,结合增殖指数,hTR、hTRT表达的半定量结果对影响睑板腺癌预后因素进行综合评估。 结果 hTR在睑板腺癌中的阳性表达率为84.45％,hTRT的阳性表达为51.8％,hTR及hTRT在睑板腺癌中的表达明显高于癌旁组织、霰粒肿、睑板腺腺瘤(P<0.01)。hTR与睑板腺癌的分化有关(r=0.455,P<O.01);hTRT与肿瘤增殖指数Ki-67有关(r=0.410,P<0.01)。 结论 睑板腺癌变过程中,端粒酶RNA(hTR)及催化亚单位基因hTRT对端粒酶激活具有上调作用;hTR阳性表达与睑板腺癌的分化状态呈负相关,hTRT与睑板腺癌的增殖有关。

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的研究

目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。

靶向端粒酶调节相关基因TRAP siRNA表达载体的构建

目的构建靶向端粒酶调节相关基因TRAP的siRNA表达载体。方法根据siRNA设计原则,设计并化学合成2段编码短发夹RNA序列、靶向端粒酶调节相关基因TRAP的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到线性化的pSilencerTM21u6neo质粒U6启动子下游重组构建RNAi质粒。结果重组质粒pSilencerTM21u6neoTRAP经过插入片段基因序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预定位子,并且序列完全一致。结论成功构建靶向TRAP基因的siRNA表达载体,为进一步研究TRAP在调控hTERT的表达、降低端粒酶活性和肿瘤的基因治疗方面的作用做了基础。

人乳头瘤病毒生物状态和人端粒酶RNA组分基因扩增与宫颈病变的关系

目的:探讨人乳头瘤病毒(HPV)生物状态和人端粒酶RNA组分(hTERC)基因扩增与子宫颈病变之间的关系。方法:应用原位杂交(ISH)和荧光原位杂交(FISH)方法,分别检测114例宫颈石蜡包埋组织HPV生物状态及hTERC基因的异常扩增。结果:在非CIN、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌宫颈组织标本中hTERC基因表达率分别为2.78%、10.00%、50.00%、78.37%和86.67%,差异有统计学意义(χ2=55.56,P<0.001)。随着病变程度升高,HPV整合发生率逐渐升高(0.0%、10.00%、18.75%、72.97%、80.00%)。不同程度的宫颈病变HPV整合率有显著差异(χ2=52.49,P<0.001)。其中,非CIN组与CINⅢ、宫颈癌组之间差异有统计学意义,CINⅠ与CINⅢ、宫颈癌组之间差异有统计学意义,CINⅡ与CINⅢ、宫颈癌组之间差异有统计学意义。HPV DNA整合情况和hTERC基因扩增情况一致,用两种方法预测宫颈癌的效果一致。结论:HPV生物状态和TERC基因扩增与子宫颈病变的发生发展相关。HPV感染与HPV整合、端粒酶激活有时序性差异,但HPV整合和hTERC基因扩增的时序性和关联性有待进一步探讨。

鸡端粒酶RNA基因的克隆

本研究采用扩增条件优化的PCR扩增技术,以MDCC-MSB1细胞基因组DNA为模板扩增出鸡端粒酶RNA(chicken telomerase RNA,chTR)全长基因,克隆到pMD18-T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定后测定序列。序列分析表明所克隆的鸡端粒酶RNA基因全长465bp,其中模板区的11个核苷(5'-CUAACC-CUAAU-3')合成端粒亚单位(TTAGGG)n。chTR基因的克隆为进一步研究chTR在马立克氏病发病过程中的作用以及马立克氏病的发病机制提供可能的序列基础。

端粒酶RNA反义基因对肝癌细胞的影响

用RT-PCR的方法钓取端粒酶RNA基因的cDNA,并将其反向插入到逆转录病毒载体pLNCX上,构建hTR基因的反义表达质粒。将质粒经脂质体介导转染人肝癌SMMG-7721细胞中表达。结果表明hTR反义基因的表达有效地封闭或抑制肝癌细胞的端粒酶活性,抑制细胞的生长和增殖,延长细胞的倍增时间并促进细胞凋亡。

shRNA慢病毒对人口腔鳞状细胞癌细胞端粒酶卡侯体蛋白1基因的沉默效应

目的探讨shRNA慢病毒对人口腔鳞状细胞癌Cal27细胞系端粒酶新蛋白,即端粒酶卡侯体蛋白1(TCAB1)基因的沉默效应,以期探索肿瘤基因治疗的新途径。方法根据TCAB1基因,构建慢病毒shTCAB1-A～D,测定病毒滴度;用重组慢病毒体外感染Cal27细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达推断感染效率;半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TCAB1 mRNA水平;Western blot检测TCAB1蛋白质的表达水平;四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测细胞体外增殖能力;Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力改变。结果经PCR与测序鉴定证实成功构建靶向TCAB1的慢病毒RNAi载体,病毒滴度为1.5×108～3×108U·mL-1。荧光显微镜观察显示,绝大部分细胞表达绿色荧光。与空白细胞对照组相比,4种不同的shTCAB1-A～D慢病毒感染组TCAB1 mRNA表达下调48.7%～62.0%;蛋白抑制率达45.6%～77.5%,shTCAB1-C组最明显。shTCAB1-C慢病毒能明显抑制Cal27细胞增殖能力,也能降低其侵袭能力,穿过人工基底膜的平均细胞数明显低于空白对照组及非特异性对照组,侵袭抑制率高达67.5%(P<0.05)。结论成功构建并包装了端粒酶新蛋白TCAB1靶向的RNAi慢病毒,该病毒可高效感染人口腔鳞状细胞癌细胞,产生特异性的基因沉默效应。

端粒酶hTERT基因siRNA表达质粒的构建和鉴定

目的:构建含人端粒酶逆转录酶(Humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)基因不同位点的一系列siRNA真核表达质粒mU6-hTERT1～5,为以端粒酶为靶点的基因治疗鼻咽癌研究奠定基础。方法:将人工合成的针对hTERT基因4个不同位点和1个混乱序列的正反链DNA序列经基因重组定向克隆插入到真核表达质粒载体mU6中,通过PCR检测确定重组结果。根据260nm处紫外红吸收值计算重组质粒的浓度。结果:各对DNA序列均按正确方向插入pmU6质粒,纯度和浓度均符合实验要求。结论:成功构建成了含人端粒酶hTERT基因4个不同位点的siRNA真核表达质粒。

人子宫颈组织中端粒酶人端粒酶RNA组分基因表达和人端粒酶蛋白基因编码催化蛋白亚基mRNA的相关性分析

目的探讨端粒酶、人端粒酶RNA组分(hTR)基因表达、分布及其与人端粒酶蛋白基因编码催化蛋白亚基(hTERT)基因表达的关联性。方法对51例宫颈活检组织进行端粒酶hTR、hTERT基因原位杂交检测。结果51例组织中28例hTR原位杂交阳性,32例hTERT阳性,表达随着病变的严重程度而增加。在高度鳞状上皮内病变(HSIL)/宫颈鳞状上皮癌(SCC)和低度鳞状上皮内病变(LSIL)/炎症组间差异有统计学意义,而且hTR和hTERT表达具有相关性(P<0.05)。结论在宫颈病变组织中,检测hTR基因表达情况可用于宫颈癌的早期诊断和鉴别。

短发夹状RNA对PC-3M细胞端粒酶逆转录酶基因表达和端粒酶活性的影响

目的:研究短发夹状RNA(shRNA)对PC 3M细胞中端粒酶逆转录酶(hTRT)基因表达及端粒酶活 性的影响。方法:构建针对hTRT基因的shRNA表达质粒psilencer TRT,在质脂体介导下转染人前列腺癌PC 3M细胞,应用RT PCR及免疫组织化学检测hTRTmRNA及蛋白表达水平,应用SYBR Green染色法检测端粒 酶活性的变化。结果:重组体psilencer TRT转染细胞24h和48h后显著下调hTRTmRNA及蛋白水平,作用 48h后,其抑制率分别为85.39%和79.17%,较空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。同时,随着时间的延 长,端粒酶活性亦有明显下降(P<0.01)。结论:利用短发夹状RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为前 列腺癌的基因治疗提供新思路。

人乳头瘤病毒L1及人端粒酶RNA基因在高危型人乳头瘤病毒阳性子宫颈脱落细胞中的表达

目的:分析高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)阳性患者子宫颈脱落细胞中人乳头瘤病毒L1基因(L1)及人端粒酶RNA基因(h TERC)的表达情况。方法:自就诊于我院和温州医科大学二附院HPHPV阳性者中,选取90例宫颈组织正常者作为A组,选取90例宫颈上皮内瘤变者作为B组,选取90例宫颈癌者作为C组,对比分析三组间L1及h TERC表达情况。结果:三组间L1位点中Cp G-1、Cp G-2及Cp G-3位点的甲基化水平间存在显著差异,均以C组水平最低,以A组水平最高(P<0.05)。三组间h TERC阳性表达率存在显著差异,C组阳性表达率为83.33%最高,A组阳性表达率为26.67%最低(P<0.05)。结论:在HP-HPV阳性者中,以宫颈癌者L1位点中Cp G-1、Cp G-2及Cp G-3位点的甲基化水平及h TERC阳性表达率最高。

端粒酶RNA基因在白细胞中表达的研究

用 RT- PCR的方法钓取端粒酶 RNA ( h TR)基因的 c DNA,将 h TR基因克隆到逆转录病毒载体( p L NCX)构建哺乳动物细胞表达质粒 ,然后经脂质体介导转染人体正常的外周血白细胞中表达。结果表明端粒酶RNA基因的表达 ,不能激活或重建白细胞的端粒酶活性。流式细胞技术分析结果显示 ,外源 h TR基因的表达不能延长白细胞的寿命 ,反而抑制白细胞的增殖并促进其凋亡。这可能是因为外源 h TR基因的表达一定程度上阻碍了细胞内端粒酶 RNA同端粒酶催化亚基的结合 ,同时也阻碍了端粒酶 RNA模板区与端粒 DNA之间的结合 ,从而影响端粒酶活性 。

端粒酶逆转录酶、RNA成分和相关蛋白1基因在肺癌组织中的表达及其临床意义

用逆转录 PCR(RT- PCR)法对手术切除的 4 0例肺癌组织 ,9例肺部良性实质性病变和 2 2例癌旁正常组织的端粒酶逆转录酶 (h TERT)、 RNA成分 (h TR)和相关蛋白 1(h TEP1) m RNA表达进行了检测 ,并与肺癌的病理分型、TNM分期进行了比较。发现肺癌组织、肺部良性实质性病变、癌旁正常组织的 h TR、h TEP1普遍呈阳性表达 ,3组间阳性率比较差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ,而 h TERT基因表达肺癌组织 (32 / 4 0 ,80 % )高于良性实质性病变 (5 / 9,5 6 % ) ,也高于癌旁正常组织 (3/ 2 2 ,13% ) ,3组间差异有极显著性 (P<0 .0 0 1)。h TERT在肺癌组织中的表达率 期 (14 / 14 ,10 0 % )高于 期 (11/ 14 ,78% ) , 期高于 期 (7/ 12 ,5 8% )。鳞、腺癌间 h TERT m RNA表达无显著差异。结果表明 :端粒酶基因表达上调在肺癌发生发展中起重要作用 ,端粒酶也参与部分肺部良性实质性病变发病机制 ;用 RT- PCR检测 h TERT m RNA表达有助于肺癌恶性程度的判断和肺部良。

载体介导的RNA i技术对HL-60细胞端粒酶逆转录酶基因表达和细胞增殖的影响

目的探讨由载体介导的靶向端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA i技术对人类髓系白血病HL-60细胞hTERT基因表达和细胞增殖的影响。方法用表达针对hTERT基因siRNA的质粒载体转染HL-60细胞,以转染后24、72、120 h细胞组作为3个实验组,以空质粒组、转染试剂组及空白对照组作为3个对照组,RT-PCR法检测HL-60细胞hTERT基因mRNA的表达,MTT法检测HL-60细胞增殖活性。结果转染后24、72、120 h组HL-60细胞hTERT基因mRNA相对表达水平分别为0.31±0.08、0.28±0.05、0.32±0.06,质粒组、转染试剂组、空白对照组分别为0.55±0.13、0.49±0.08、0.58±0.19,3个实验组HL-60细胞hTERT mRNA表达水平低于3个对照组,差异有显著性(P<0.05),3个实验组组间比较差异无显著性(P>0.05),3个对照组间表达水平比较差异无显著性(P>0.05);24、72、120 h实验组细胞增殖活性抑制率分别为(23.7±4.0)%、(35.1±5.9)%、(29.6±3.8)%,质粒组分别为(3.7±0.8)%、(2.1±0.5)%、(2.7±0.9)%,转染试剂组分别为(4.0±1.8)%、(2.6±1.3)%、(2.2±1.1)%,空白对照组均为0,3个实验组HL-60细胞增殖活性抑制率明显高于各对照组,差异有显著性(P<0.05),3个实验组及组间比较差异无显著性(P>0.05),3个对照组组间比较差异无显著性(P>0.05)。结论载体介导的靶向hTERT基因的RNA i技术能在体外抑制HL-60细胞hTERT基因的表达,细胞增殖活性受抑制。

SiRNA沉默HBx对HepG2.2.15细胞人端粒酶逆转录酶基因表达的影响

目的探讨应用RNA干扰技术沉默HBx对HepG2.2.15细胞中hTERT基因表达的影响。方法 (1)将pSIHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR法评估沉默效率。(2)MTT法检测转染24h、48h、72h后细胞增殖情况。(3)Real-time PCR和Western blot检测hTERT表达情况。结果测序结果显示pSIHBV/X质粒构建正确;RT-PCR检测HBV x基因的沉默效率为53.6%;MTT检测结果显示转染24h、48h、72h后HepG2.2.15细胞的增殖受抑制,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);Real-time PCR和Western blot检测结果均显示,转染pSIHBV/X质粒后HepG2.2.15细胞中hTERT基因的mRNA水平和蛋白水平表达分别有不同程度的下调,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 siRNA沉默HBx基因可抑制HepG2.2.15细胞中癌症标志基因hTERT的表达。