靶向人乳头瘤病毒16型-E6的siRNA对宫颈癌肿瘤生长的影响

目的研究靶向HPV16-E6的小分子干扰RNA抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长。方法建立裸鼠宫颈癌模型,HPV16-E6siRNA瘤体内多点注射观察肿瘤的生长情况,使用HE染色方法观察肿瘤组织细胞在pSiRNA或pCON治疗后的病理学改变;免疫组化采用SP法。结果靶向HPV16-E6的小分子干扰RNA能显著抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长。结论利用宫颈癌裸鼠移植瘤模型,证明靶向HPV16-E6的siRNA能够显著抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长。

人类疱疹病毒6型及人乳头瘤病毒16型感染与宫颈癌发生、发展关系的研究

目的 :研究人类疱疹病毒 6型 (hHV 6 )及人乳头瘤病毒 16型 (hPV 16 )感染与宫颈癌发生、发展的关系。方法 :应用巢式多聚酶链反应 (nested PCR)检测hHV 6及多聚酶链反应 (PCR)检测hPV 16在 16份正常宫颈、2 0份宫颈炎症、6份宫颈上皮内瘤样病变 (CIN)Ⅰ～Ⅱ级及 34份宫颈癌组织中的感染情况。结果 :宫颈癌组织中hHV 6DNA阳性率为 6 1.76 % (2 1/34) ,明显高于正常组、炎症组及CINⅠ～Ⅱ级组 (P <0 .0 1)。宫颈癌组织中hPV 16DNA阳性率为 76 .4 7% (2 6 /34) ,明显高于正常组的 12 .5 0 %和炎症组的15 .0 0 % (P <0 .0 1)。 2 1份hHV 6DNA阳性组织中的hPV 16DNA也全部阳性 ,二者在宫颈癌组织中呈高度一致性。随着宫颈癌临床期别的增加 ,hHV 6和hPV 16DNA阳性率均呈递减趋势 ,但差异不显著 (P >0 .0 5 )。结论 :hHV 6感染与宫颈癌的发生密切相关 ,可能是宫颈癌的致病因子 ,作为“促进子”(promoter)与hPV 16协同促使宫颈癌进展。

老年宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16-E6、p53 mRNA表达及其与放疗敏感性的相关性

目的分析老年宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒(HPV)16-E6、p53 mRNA表达及其与放疗敏感性的关系。方法 40例宫颈癌患者均按计划进行根治性放射治疗前后采用实时定量反转录聚合酶链反应(PT-PCR)检测宫颈癌组织中HPV16-E6、p53 mRNA的表达水平,并根据治疗结果分为有效组29例和无效组11例,分析HPV16-E6、p53与放疗敏感性的关系。结果治疗总有效率为72.50%;放疗前后无效组2例HPV16-E6、p53 mRNA和蛋白差异无统计学意义(P>0.05),放疗前后有效组4例HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA表达水平明显改善,HPV16-E6蛋白表达水平显著低于无效组,p53蛋白表达水平显著高于无效组(P<0.05)。结论 HPV16-E6感染、p53基因异常参与了老年宫颈癌发生、发展过程,检测HPV16-E6、p53 mRNA的表达可判断宫颈癌组织放疗敏感性。

调控细胞分裂周期蛋白6对人类乳头瘤病毒16阳性宫颈癌细胞Caski增殖和凋亡的影响

目的探讨调控细胞分裂周期蛋白6(CDC6)对人类乳头瘤病毒(HPV)16阳性宫颈癌细胞Caski增殖和凋亡的影响。方法检测HPV阴性的宫颈癌C33-A细胞株、HPV16阳性的宫颈癌Caski细胞株和SiHa细胞株、HPV18阳性的宫颈癌HeLa细胞株中CDC6蛋白及mRNA的表达水平。将CDC6小干扰RNA(siRNA)-1、siRNA-2、siRNA-NC分别转染入宫颈癌Caski细胞(分别设为CDC6 siRNA-1组、CDC6 siRNA-2组、siRNA-NC组),并设立空白对照组,24 h和48 h后分别检测各组CDC6 mRNA和蛋白的表达水平,筛选出最佳的siRNA序列。转染后,检测最佳siRNA序列的CDC6 siRNA组、siRNA-NC组、空白对照组的细胞增殖能力、细胞周期及细胞凋亡率。结果(1)Caski细胞、HeLa细胞、SiHa细胞、C33-A细胞的CDC6 mRNA的相对表达量依次降低;C33-A细胞CDC6蛋白的相对表达量低于其他3种细胞,Caski细胞和HeLa细胞CDC6蛋白的相对表达量均高于SiHa细胞(均P<0.05)。(2)CDC6 siRNA-1组CDC6 mRNA及蛋白相对表达量低于CDC6 siRNA-2、siRNA-NC组与空白对照组(均P<0.05),故选用siRNA-1序列进行后续研究。(3)转染48 h后,与siRNA-NC组与空白对照组比较,CDC6 siRNA-1组的细胞增殖能力降低,细胞凋亡率增加,细胞G 1期变长、G 2期缩短(均P<0.05)。结论沉默CDC6能够有效干扰HPV16阳性宫颈癌Caski细胞的增殖,靶向抑制CDC6有望成为早期治疗宫颈癌的新途径。

人类乳头瘤病毒16型E7C亚基因在耻垢分枝杆菌中的表达

目的在耻垢分枝杆菌Mycobaterium smegmatis mc2155中表达人类乳头瘤病毒16型E7C亚基因,为其重组BCG疫苗的研究奠定基础。方法采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG-E7C导入耻垢分枝杆菌(M.smegmatismc2155)中,通过卡那霉素抗性筛选经PCR鉴定的重组M.smegmatis mc2155,培养于middlebrook7H9 broth(M7H9)培养基中,并添加10%M7H9 enrichment ADC和0.05%Tween 80,37℃培养48 h^72 h,42℃诱导表达5 h,表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot分析。结果成功构建pBCG3000-E7C质粒,SDS-PAGE显示表达产物的分子质量单位约为6.5 ku,与预期理论值相符,Western blot分析表达产物能被宫颈癌患者血清识别。结论人类乳头瘤病毒16型E7C基因在M.smegmatis mc2155中成功表达。

宫颈癌人类乳头状瘤病毒16/18型感染及增殖细胞核抗原表达的意义

宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，近年来发病率有升高趋势。宫颈人类乳头状瘤病毒（human papillomavirus。HPV）感染是宫颈癌的主要危险因素，高达90％以上的患者伴有HPV感染。HPV16型、18型的感染与宫颈鳞癌直接相关，在83．3％f10宫颈鳞癌组织中，可检测到HPV16、HPV18的DNA。

人类乳头瘤病毒16/18与宫颈癌相关性的研究进展

人类宫颈癌(Cervicalcarcinoma)在全世界范围内相当流行,发展中国家情况更为严重。大量的科学研究发现,高危型人类乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)16/18(HPV16/18)与宫颈癌的关系最为密切。本文着重从高危型HPV16/18的基因结构、基因产物及其感染人类宫颈细胞后所引起的细胞基因、染色体、端粒酶及机体免疫系统的变化,作一综述。

宫颈鳞癌与转化生长因子β1的表达及人类乳头瘤病毒16E6基因多态性的关系

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)表达及人乳头瘤病毒(HPV)16E6基因突变与宫颈癌发生发展的关系,阐明TGF-β1在宫颈癌发生中的作用机制。方法:收集2007年5月—2009年1月住院手术患者的新鲜宫颈组织,分为宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级17例、CINⅡ-Ⅲ级17例及宫颈鳞状细胞癌39例,用免疫组织化学法检测组织标本中TGF-β1蛋白表达,用PCR法及直接测序检测组织HPV16E6基因,分析其与宫颈癌发生发展的相关性。结果:CINⅠ、CINⅡ-Ⅲ及宫颈鳞癌组织中TGF-β1的阳性率分别为11.8%、35.3%及64.3%,其阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01)。晚期宫颈鳞癌(ⅡB-Ⅳ期)患者TGF-β1表达率为88.9%,显著高于早期宫颈鳞癌(ⅠB-ⅡA)患者(76.7%)(P<0.01)。HPV16E6在CINⅠ、CINⅡ-Ⅲ组和宫颈鳞癌组织中的检出率分别为11.8%、41.2%和82.1%,其检出率组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。HPV16E6的阳性率与宫颈病变的进展程度呈正相关(r=0.592,P=0.001)。经基因测序,用DNAman软件对测序结果进行比对分析显示,共14例与标准株序列相同,最常见的突变位点是D25E,检出率为42.5%。HPV16E6为非突变型患者中,其TGF-β1阳性率为50.0%;而在HPV16E6D25E患者中,其TGF-β1阳性率为92.9%(P<0.05)。结论:TGF-β1的表达与宫颈鳞癌的发生发展有关,HPV16E6多态性可能与TGF-β1促进癌细胞的生长及侵袭有关。

新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中乳头瘤病毒16型E6基因的克隆和序列分析

为了分析新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16型E6基因结构特点 ,从中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取DNA ,以宫颈癌活检组织标本DNA为模板进行PCR扩增 ,获得HPV16E6基因 ,将其克隆到pUCm T载体上 ,并对其进行基因全序列分析 .PCR检测结果显示宫颈癌组织中HPV16E6阳性率为 82 35 % (14/17) ;测序结果显示 ,新疆株HPV16E6基因全长 45 6bp ,大小与德国标准株一致 .E6基因的第 2 47位碱基发生T→G突变 ,并由此引起所编码的氨基酸亦发生改变 .上述结果表明 ,中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌患者组织中HPV16E6的基因结构与德国标准株HPV16E6基因之间存在差异 .

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

背景与目的:人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirus16,HPV16)的早期基因E6、E7可分别诱导p53的泛素化降解和pRb的高磷酸化失活,与宫颈癌的发生发展关系密切。本研究通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达,探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。方法:利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞,利用RT-PCR和Westernblot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化,利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。结果:转染携带HPV16型E6、E7反义基因的质粒后,SiHa细胞的E6、E7基因的mRNA和蛋白表达均明显下调;MTT结果显示转染后细胞的增殖活性(0.50±0.05)与转染空载体细胞(1.01±0.06)和未转染细胞(1.28±0.06)比较明显降低(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示转染后细胞凋亡率(59.3±11.3)%与转染空载体细胞(9.4±1.8)%和未转染细胞(2.1±0.4)%比较有显著性差异(P<0.05)。激光共聚焦显微镜结果示转染后细胞凋亡明显增多。结论:HPV16型E6、E7基因反义RNA可降低宫颈癌细胞中E6、E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡。

人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达

目的 构建HPV 18L1 E6、L1 E7嵌合基因的表达载体 ,并在CHO细胞中表达。方法 克隆HPV 18L1 E6和L1 E7基因 ,插入中介载体 pGEMT Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法 ,突变L1 E6、L1 E7基因序列中与转化作用相关的位点 ,分别与L1基因连接后插入真核表达载体 pVAX1,构建真核表达质粒 pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx。用磷酸钙沉淀法 ,转染CHO细胞 ,以抗HPV 18L1、抗E6和抗E7特异性单克隆抗体 (mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测。结果 ELISA检测显示 ,转染各种pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P N值均 >2 .1;免疫细胞化学检测 ,在胞浆、胞核可见棕黄色颗粒。结论 所构建的 pVAX1 L1E6Mxx E7Mxx融合蛋白表达质粒 ,可在转染细胞内表达相应的L1 E6Mxx和L1 E7Mxx蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础。

人乳头瘤病毒16/18型E6蛋白在宫颈病变中的意义及对预后的预测价值

目的·探讨人乳头瘤病毒16/18型(HPV16/18)E6蛋白在不同级别宫颈病变组织中表达的临床意义及对疾病预后的预测价值。方法·采用免疫组化法检测10例正常宫颈组织、33例宫颈上皮内瘤变Ⅰ(cervical intraepithelial neoplasiaⅠ,CINⅠ)组织、31例CINⅡ?-?Ⅲ组织、30例宫颈癌手术病理标本中HPV16/18 E6蛋白的表达,分析其表达差异、与宫颈癌临床病理特征及不同CIN疾病进展之间的关系。结果·HPV16/18 E6阳性表达率在CINⅠ、CINⅡ?-?Ⅲ、宫颈浸润癌中依次增强(χ~2=19.82,P=0.000)。HPV16/18E6在低分化、直径大于4 cm的宫颈癌肿瘤中阳性表达率增高(P=0.033,P=0.011)。HPV16/18 E6过表达程度与宫颈癌病理学分级、肿瘤直径、不良预后之间成正相关(r=0.456,P=0.011;r=0.578,P=0.000;r=0.645,P=0.000)。HPV16/18 E6阳性表达对CINⅠ、CINⅡ?-?Ⅲ、宫颈癌进展预测的灵敏度分别为100.00%、62.50%、43.75%,特异度分别为96.77%、91.30%、92.86%,诊断符合率分别为96.97%、83.87%、66.67%。结论·HPV16/18 E6蛋白在宫颈癌发生发展及不良预后中发挥了重要作用,对宫颈疾病进展具有良好的预测价值,且对CIN疾病分层管理具有指导意义。

人乳头状瘤病毒16 E7 DNA在结直肠腺癌组织中的表达

结直肠癌与人类乳头状瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染有一定的关系,但由于检测方法、标本选择及样本数量不同,各研究结果之间差异很大。为进一步明确结直肠癌变与HPV16感染的关系,采用多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)对82例原发性结直肠腺癌患者手术切除的新鲜癌及癌旁正常粘膜组织进行了前瞻性对照研究,检测了组织中HPV16E7DNA的表达并进行测序鉴定。结果显示,结直肠腺癌组织HPV16E7的表达阳性率(42/82)明显高于癌旁正常粘膜组织(4/82);直肠癌组织中HPV16E7的表达(64.10%)明显高于升结肠癌(18.18%),即癌灶部位距肛门越近,感染率越高;HPV16阳性率与Dukes分期相关,Dukes分期越晚感染率越高;与癌组织分化程度无相关性。结果提示结直肠癌的发生、发展可能与HPV16感染有关。

宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析

目的 分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒 16型 (HPV16型 )E6基因的结构特点。方法 采用PCR技术扩增了 1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16E6基因 ,并对其进行了克隆及全序列分析。结果 成功地克隆了HPV16E6基因 ,与GenBank收录的原型相比 ,E6基因中有 2个碱基发生突变 ,推导其编码的氨基酸有 1个发生了变化。

人乳头瘤病毒16型E6蛋白高表达下调LPS诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β

目的将人乳头瘤病毒16型(HPV 16)E6蛋白真核表达载体pcDNA3.1(-)/E6转染巨噬细胞,观察E6蛋白瞬时高表达对LPS诱导的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的影响,为进一步研究HPV16E6蛋白的致病机制奠定实验基础。方法将质粒pcDNA3.1(-)/E6通过SuperFectTM脂转染试剂转染巨噬细胞24h后,用LPS刺激巨噬细胞,利用Western-blotting鉴定E6蛋白在巨噬细胞中的表达,ELISA检测pcDNA3.1(-)/E6转染的巨噬细胞不同时间(12、24及48h)培养上清液中TNF-α与IL-1β的含量,统计软件SPSS12.0分析所得数据。结果Western-blotting结果显示pcDNA3.1(-)/E6能在巨噬细胞中表达约18kD的目的蛋白,即E6蛋白;pcDNA3.1(-)/E6+LPS组培养上清中TNF-α与IL-1β的量明显低于巨噬细胞+LPS组和pcDNA3.1(-)+LPS组,pcDNA3.1(-)/E6+LPS组与巨噬细胞+LPS组和pcDNA3.1(-)+LPS组比较,差异具有显著性(P<0.01)。结论HPV16E6蛋白瞬时高表达下调LPS诱导的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α与IL-1β。

P16 INK4a蛋白及人乳头瘤病毒检测对宫颈癌前病变的预测价值

目的探讨P16 INK4a蛋白及人乳头瘤病毒(HPV)DNA对检测宫颈癌前病变的预测价值。方法收集2008年11月—2011年10月在上海交通大学医学院附属第一人民医院松江分院经细胞学筛查、阴道镜活检、组织病理学诊断为宫颈上皮内瘤变(CIN),并根据病变程度和患者意愿行宫颈锥切治疗的705例患者作为研究对象。分析P16 INK4a蛋白及HPV DNA检测对疾病的预测价值。结果 P16 INK4a蛋白阳性率在CINⅢ中高于HPV DNA阳性率(χ2=8.78,P<0.05),且P16 INK4a蛋白的阳性率与病变程度呈正相关(r=0.258,P<0.05),而HPV病毒阳性率与病变程度呈负相关(r=0.530,P<0.05)。结论 P16 INK4a蛋白比HPV DNA对检测CINⅢ具有更高的敏感性,所以HPV DNA联合P16 INK4a蛋白检测对CIN有更高的预测价值。

人乳头状瘤病毒16型E6蛋白在食管癌中的表达及与Cyclin D1的关系

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)16型E6蛋白在食管癌中的表达及与细胞周期蛋白Cyclin D1的关系。方法采用免疫组织化学法检测50例食管鳞癌组织、30例食管癌旁组织及30例正常食管黏膜组织中HPV 16型E6蛋白的表达情况,采用Western blot方法检测Cyclin D1在HPV 16型E6蛋白阳性及阴性的食管鳞癌组织中的表达水平。结果食管鳞癌组织中HPV 16型E6蛋白的阳性表达率高于正常食管黏膜组织(P<0.05),与食管癌旁组织差异无统计学意义(P>0.05);肿瘤最大径较大者、肿瘤浸润较深者、淋巴结转移者HPV 16型E6蛋白的阳性表达率均较高(P<0.05)。HPV 16型E6蛋白阳性的食管鳞癌组织中Cyclin D1蛋白表达量高于阴性者(P<0.05)。结论 HPV 16型E6蛋白可能促进了食管癌的生长和恶化,并与Cyclin D1有一定的相关性,可作为食管癌的预后评估因子,为临床治疗提供一定的参考依据。

人乳头瘤病毒16E6基因沉默对鼻咽癌细胞侵袭转移能力及细胞周期的影响

目的观察针对人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16E6基因的RNA干扰(RNA interfering,RNAi)对人鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)HNE-1细胞侵袭转移能力及细胞周期的影响,探讨HPV16E6基因作为鼻咽癌基因治疗标靶的可行性。方法根据基因库上的HPV16E6mRNA序列,设计合成针对HPV16E6的siRNA,转染HNE-1细胞,采用RT-PCR及Westernblot分析E6基因的表达,利用侵袭实验检测细胞的侵袭能力,MTT法检测细胞的生长增殖,流式细胞术检测细胞周期。结果针对HPV16E6的siRNA下调鼻咽癌HNE-1细胞株E6mRNA和蛋白表达水平,分别下调66.3%、56.7%(P<0.05);侵袭实验结果显示,siRNA转染组的穿膜细胞数为(45.3±4.0),显著低于阴性对照组[(147.7±4.7),P<0.05];转染组细胞的增殖受到抑制,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术显示细胞阻滞于G0/G1期。结论siRNA可以有效干扰鼻咽癌HNE-1细胞内HPV16E6基因的表达,进而影响HNE-1细胞的侵袭转移能力,并抑制肿瘤细胞的生长增殖,使细胞周期重新分布。

早期喉癌人乳头状瘤病毒感染和P53、P16、nm23蛋白表达及端粒酶激活相关性分析

目的:初步探讨早期喉癌发生与人乳头状瘤病毒(HPV)16/18感染及P16、P53、nm 23基因表达、端粒酶启动的相关性。方法:采用免疫组织化学方法、原位杂交及TRAP法分别检测了62例早期喉癌手术标本、14例癌前病变标本及12例正常声带粘膜/声带息肉标本的P53、P16、nm 23-H1蛋白的表达,HPV 16/18 DNA、端粒酶活性的检出率,并进行了统计学分析。结果:(1)早期喉癌中P16表达检出率低于正常声带粘膜/声带息肉及癌前病变的检出率(P<0.01);早期喉癌中P53表达检出率高于正常声带粘膜/声带息肉(小结)及癌前病变的检出率(P<0.05),癌前病变的检出率高于正常声带粘膜/声带息肉(小结)检出率(P<0.05)。nm 23H1表达在上述不同标本中无显著性差异。癌前病变及癌组织标本中有70％有端粒酶激活,对照组为0％。(2)癌前病变及癌组织63％(48/76)有HPVl6/18感染,对照组为0％。(3)与HPV阴性标本比较,HPV阳性标本中P16表达检出率减少,P53表达检出率及端粒酶启动增多。结论:喉癌的发生与喉粘膜P16表达下调、P53表达上调及端粒酶启动相关;P53表达上调可能是癌变的早期事件;HPV感染可能介导并促进P16、P53的表达失调及端粒酶启动,在喉癌发生中起重要作用。