HIV-1假病毒的构建及对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系的感染研究

目的:分离、克隆水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的包膜糖蛋白(VSV-GP)编码基因,包装人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)假病毒,并研究其对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系BCBL-1细胞的感染状况。方法:根据GenBank登记的VSV-GP基因核苷酸序列设计1对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以质粒pHCMV-G为模板,PCR扩增VSV-GP基因,经双酶切后定向克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pVSV-GP。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后与含包装和复制功能缺陷的HIV-1基因组重组质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染人胚肾HEK293T细胞,收获细胞进行Western blot,检测HIV-1p24蛋白的表达;收获HIV-1假病毒感染BCBL-1细胞,进行虫荧光素酶(Luciferase)报告基因活性检测以及用ELISA的方法检测感染后细胞上清中HIV-1p24蛋白的含量。结果:PCR分离、克隆的VSV-GP序列全长1536bp,序列经过核酸分析证实;Western blot在HIV-1p24蛋白预期位置检测到特异性条带;HIV-1假病毒感染BCBL-1细胞后上清可以检测到HIV-1p24蛋白,并且测得Luciferase活性值较对照组显著增高(P<0.05)。结论:成功包装了HIV-1假病毒,并且该病毒可以感染BCBL-1细胞。

穿心莲内酯靶向Akt信号干预HIV感染T细胞的效率研究

目的探讨穿心莲内酯靶向Akt信号干预人类免疫缺陷病毒(HIV)感染T细胞的效率。方法培养Jurkat T细胞,用WST-1试剂检测穿心莲内酯干预对Jurkat T细胞活性的影响。将Jurkat T细胞分为空白对照组、穿心莲内酯组、LY294002组(PI3K抑制剂)及穿心莲内酯联合LY294002组。各组药物分别干预24 h后,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组细胞PI3K、Akt mRNA相对表达量,采用Western blotting检测各组细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量。制备HIV假病毒,用假病毒感染各组细胞,萤光素酶系统检测假病毒感染Jurkat T细胞的效率。结果WST-1试剂检测结果显示,随着穿心莲内酯浓度增加,Jurkat T细胞活力降低(P<0.05)。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,穿心莲内酯降低Jurkat T细胞PI3K及其下游Akt mRNA相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量(P<0.05)。HIV假病毒感染实验结果显示,穿心莲内酯降低HIV假病毒感染Jurkat T细胞的效率,联合组比单独组的抑制效果更好(P<0.05)。结论穿心莲内酯可能通过PI3K降低其下游Akt的活化,从而减少HIV假病毒在Jurkat T细胞间的传播及进入细胞的机会,降低其感染Jurkat T细胞的概率。

HIV假病毒模型优化及其在中医药防治艾滋病研究中的应用探讨

中医药治疗艾滋病有一定疗效,但亟需研究其作用机制,因此建立稳定可靠模型尤为必要。HIV假病毒安全性高、稳定性强,筛选优势毒株构建假病毒感染细胞模型研究中药作用机制可行可信。假病毒模型已应用于体外药物筛选、中和抗体检测、表型耐药检验系统、宿主与病毒相互作用等研究方面。笔者在分析中药作用特点及中药研究手段的基础上,提出筛选优势毒株、优化病毒制备和感染过程可构建稳定可靠的假病毒感染细胞模型,并且可应用于中药多靶点的机制探讨及网络药理学活性中药筛选等,以期为更好地开展中医药防治艾滋病临床基础研究提供借鉴。