抗人类免疫缺陷病毒1型广谱中和抗体的研究进展

现行抗反转录病毒治疗药物的联合应用可有效抑制艾滋病进程并显著延长患者寿命,但由于人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)潜伏库的存在,艾滋病迄今尚无法治愈。近年发现抗HIV广谱中和抗体能有效降低患者体内病毒载量并延缓疾病进程,为研发艾滋病疫苗和治愈策略带来了曙光,尤其是序贯免疫策略的使用极大推进了广谱中和抗体的开发和应用进程。2018年,美国食品药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准了第1个临床应用的广谱中性单克隆和抗体,无疑为抗HIV单克隆抗体药物的研发注入了一支强心剂。本文围绕近年来抗HIV广谱中和抗体的研究进展进行综述,探讨未来广谱中和抗体研发面临的挑战。

人类免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白(Gag)在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白Gag,为HIV感染的诊断和疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增获得HIV1gag基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX5X1的tac启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westernblot分析验证其表达产物。结果表达产物是相对分子质量为82000的GST融合蛋白,且能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Gag蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达,且具有良好的抗原性,可进一步用于HIV感染及动物免疫等方面的研究。

一种可抑制人类免疫缺陷病毒1型与CD4结合的小分子

除了最近证实的融合抑制物enfuvirtide(T-20)外，所有已确认的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)药物都以病毒的两个酶作为作用靶：反转录酶和蛋白酶。尽管抗反转录病毒联合疗法已取得令人瞩目的成就，但由于病毒抗药性的出现和由于药物强烈的不良反应和复杂的服药方案造成患者不配合现象，

抗人类免疫缺陷病毒广谱中和抗体与疫苗设计

自发现人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)30年来,科学家们不断探索有效的HIV-1疫苗,但至今效果不理想。由于"精英患者"的广谱中和血清能起到有效的抗病毒作用,研究人员希望通过对体液保护免疫机制的研究,推动疫苗的设计和优化,为尽早研发成功HIV疫苗提供关键理论和技术支撑。近几年来,由于技术的突破和改进,从HIV感染者中分离获得广谱中和抗体的概率和数量大大提高。本文针对近几年来分离的有代表性的广谱中和抗体,根据其不同的识别位点分为四大类进行详细介绍,并总结了从研究广谱中和抗体中所获得的疫苗设计创新思路与启示。

检测抗-HIV1标准物时样品针加样先后顺序的改变对S/CO值的影响

目的全自动酶免分析仪酶联免疫吸附试验法检测人类免疫缺陷病毒抗体1型(抗-HIV1)标准物。方法检测石景山医院患者血清样本带抗-HIV1标准物时,先加标准物后加患者血清与先加患者样本血清后加标准物这种加样针次序的改变分析对标准物血清S/CO值的影响。结果检测过程中,仪器样品针对抗-HIV1标准物与患者血清标本加样的先后顺序改变对最终S/CO值的测定是有影响的。结论后加标准物的设计模式所测值符合质控规则,而先加标准物的模式所测数值处于失控状态,提示存在系统误差。

HIV-1 CRF01_AE重组型gp120 V1/V2结构域单克隆抗体的制备与鉴定

目的真核表达人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CRF01_AE重组型gp120蛋白的V1/V2结构域,制备其单克隆抗体并鉴定其抗原反应性。方法构建pTriEx-3-V1/V2CNE55真核表达载体,在HEK293F细胞中表达V1/V2-His融合蛋白,纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选分泌抗V1/V2重组蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤,对单克隆抗体的特异性、型别以及效价进行鉴定。结果制备并获得一株稳定分泌抗HIV-1 AE亚型V1/V2结构域单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA测定腹水效价高达1∶81 000,单克隆抗体类型属于IgG1/κ型。Western blot结果表明该单克隆抗体同样能够识别不同亚型的HIV gp120蛋白。结论成功制备出抗HIV-1 AE重组型gp120蛋白V1/V2结构域的单克隆抗体。

从人类免疫缺陷病毒1型感染者中筛选中和抗体的研究

目的利用B细胞培养和RT-PCR技术从我国人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者中筛选出具有广谱中和活性的人单克隆抗体。方法本研究采集HIV-1感染者抗凝全血,分离出外周血单个核细胞,用磁珠分选纯化记忆性B细胞,在体外选择3T3-hCD40L作为饲养细胞,并使用细胞因子白细胞介素(IL)-2和IL-21诱导记忆性B细胞分泌IgG,用HIV假病毒微量中和的方法进行筛选。从有中和活性的孔中分别扩增出B细胞IgG的轻链和重链基因,并将其克隆到含IgG恒定区基因的载体上。然后将携带重链和轻链基因的质粒进行大量表达,得到人单克隆抗体,并进行抗体结合活性、中和活性及与抗原Gp120亲和力的鉴定。结果从我国3例HIV-1感染者记忆性B细胞中筛选出3株对HIV-1Env抗原有结合活性的单克隆抗体。其中8E7和55B3主要与Gp120结合,19GF3与Gp120和FLSC均可结合且结合活性无明显差异;基因变异大的8E7抗体对A、B、C三种亚型的假病毒均有一定的中和活性,55B3对SF162有中和活性,19GF3未检测到中和活性;这三种单抗的亲和力都很强,8E7、19GF3、55B3与抗原Gp120的KD值分别为6.45×10^(-10) mol/L、1.12×10^(-10) mol/L、2.76×10^(-10) mol/L。结论成功建立了在96孔板中高效刺激人B细胞在体外分泌IgG的方法,并利用HIV假病毒微量中和实验和RT-PCR技术筛选得到对HIV-1具有中和活性的人单克隆抗体。

抗人类免疫缺陷病毒1型广谱中和抗体鉴定方法研究进展

人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）主要通过包膜蛋白刺突感染CD4细胞，刺突由三个二聚体组成，每个二聚体分别由HIV病毒的包膜糖基化蛋白gp120和gp41构成。HIV-1病毒入侵宿主细胞的过程是病毒包膜蛋白gp120／gp41和宿主细胞受体相互作用的结果。HIV-1的包膜蛋白gpl20首先结合于第一受体CD4，然后经历一系列的变构暴露出趋化因子受体（共受体）的结合位点，与共受体CCR5或CXCR4作用，

不同人类免疫缺陷病毒2型检测方法的比较研究

目的通过随访调查16例人类免疫缺陷病毒2型(HIV2)可疑感染者,初步评价HIV2的几种检测方法。方法从贵州省采集既往经HIV1/2免疫印迹(WB)试验检测出现HIV2指示带的16份受检者的全血样品,进行HIV2抗体和核酸检测。血浆中的抗体用HIV1/2ELISA初筛复检,其中阳性样品再分别用HIV1/2线性免疫试验(LIA)和HIV2WB检测。外周血单核细胞(PBMC)中的前病毒DNA用HIV2巢式PCR检测。结果16份血浆样品经HIV1/2ELISA筛查均为HIV抗体阳性;用HIV1/2LIA检测,全部为HIV1抗体阳性,15份为HIV2抗体阴性、1份不确定;用HIV2WB检测,有3份为HIV2抗体阳性、13份不确定。由于这批样品的采样时间距首次检测至少1年以上,可以排除窗口期感染,上述检测结果不确定的受检者均可判为HIV2抗体阴性。此外,用巢式PCR检测所有PBMC样品均为HIV2核酸阴性。结论16例受检者全部为HIV1而非HIV2感染,HIV1/2LIA的抗体检测结果与HIV2核酸检测结果基本相符,而HIV2WB则产生了大量的不确定甚至假阳性结果。

广西壮族自治区性病门诊就诊的人类免疫缺陷病毒I型感染者丙型肝炎病毒感染的调查

目的了解广西壮族自治区性病门诊就诊的人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）感染者中丙型肝炎病毒（HCV）感染情况。方法对11553份性病门诊就诊者血浆标本进行HIV抗体筛查、确证，并采用病例对照研究方法，按年龄、婚姻状况和1：2的比例，140份HIV-1抗体确证阳性标本配对282份HIV-1抗体阴性标本。422份标本采用酶联免疫吸附试验（EusA）进行HCV抗体检测。利用卡方检验对HIV-1抗体阳性者及HIV-1抗体阴性者HCV抗体阳性率进行比较，采用Logistic回归对HCV和HIV合并感染进行危险性分析。结果HIV-1抗体阳性标本HCV抗体阳性率为33．57％（47，140），HIV-1抗体阴性标本为1．06％（3，282），后者显著低于前者（r=94．66，P〈0．05）。危险因素分析显示，多个性伴合并感染HCV和HIV的概率高于单个性伴[OR=2．4，95％CI（1．0～5．6），P=0．05]，静脉吸毒者合并感染HCV和HIV的概率高于非静脉吸毒者[OR=20．8，95％CI（5．7～76．5），P〈0．05]。结论HCV感染与HIV感染相关，对HIV-1就诊者进行综合干预能降低HCV的传播。

重庆市 HIV-1慢性感染者亚型交叉反应中和抗体的分析

目的：了解重庆市HIV-1感染者体内亚型交叉中和抗体的水平，并分析其特点，为后续表位研究和HIV-1疫苗研制提供科学数据。方法选取重庆市236份HIV-1慢性感染者为研究对象，采用国际通用的假病毒单复制TZM-bl细胞荧光检测系统，使用多个不同亚型的HIV-1假病毒株交叉筛选，对这些血浆样本进行了中和谱筛查和抗体中和能力（ID50）的检测。结果236份血浆样本中，有18份能交叉中和B和C亚型假病毒，占总样本量的7．63％；其中15份样本对多亚型假病毒表现出不同程度的型交叉中和作用。结论重庆市HIV-1慢性感染者血浆样本中存在HIV-1亚型交叉的广谱中和抗体。

2015—2018年北京市西城区HIV抗体免疫印迹试验检测结果

目的了解2015—2018年北京市西城区HIV抗体筛查有反应标本的确证结果,为艾滋病的发现、防治提供数据支持。方法2015—2018年,对北京市西城区HIV抗体筛查有反应标本使用MP生物亚太公司人类免疫缺陷病毒(HIV 1+2型)抗体检测试剂盒(免疫印迹法,WB)进行确证检测。结果对3494份HIV抗体筛查有反应标本进行WB确证试验发现,HIV-1抗体阳性标本1822份(52.15%);HIV抗体不确定标本416份(11.91%);HIV抗体阴性标本1256份(39.95%)。HIV-1抗体阳性标本中,条带gp120、gp160、p24、gp41出现频率较高,均>99.00%,条带p55出现1003份,频率最低,为55.05%。HIV抗体不确定标本中,条带p24共357份,出现频率最高,为85.82%。男女HIV-1抗体阳性感染率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。不同性别间HIV抗体不确定标本中,带型gp160、gp120反应率比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。不同年龄间HIV-1抗体阳性条带中,带型p51、p24反应率比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。不同年龄HIV抗体不确定标本中,带型gp160、gp120、gp41、p24反应率比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论WB法作为HIV抗体检测的“金标准”,其稳定性、可靠性(特异性、准确性)已得到广泛认可,此方法能够准确判断艾滋病病毒感染。但人类免疫系统复杂多样,导致HIV抗体不确定标本中各条带出现频率差异存在不确定性,需要在后续的研究中对HIV抗体不确定标本提高警惕,结合流行病学调查、核酸检测及定期随访复检等方式进一步追踪以确证结果。

HIV-1 DNA疫苗初免-重组痘苗病毒载体疫苗和蛋白疫苗加强策略的免疫原性分析

目的系统分析人类免疫缺陷病毒(HIV)-1DNA疫苗初免-重组痘苗病毒载体(rTV)疫苗和蛋白疫苗加强免疫策略在小鼠中诱导的免疫应答反应,为HIV-1疫苗研发提供备选免疫方案和免疫原性评价手段。方法采用初免-加强策略免疫BALB/c小鼠,ELISA检测特异性结合抗体,流式细胞术检测特异性细胞免疫反应。结果免疫程序中4个时间点血清样本均可持续检测到广泛的HIV-1特异性抗体(IgG、IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3);rTV疫苗免疫后10d和末次免疫后6周均可检测到HIV-1特异性的细胞免疫反应,分泌细胞因子干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-2和肿瘤坏死因子(TNF)-α;该免疫策略可诱导广泛的三功能性和双功能性T细胞免疫反应。结论 DNA疫苗初免-rTV疫苗和蛋白疫苗加强免疫策略可以在小鼠中诱导出广泛持久的HIV-1特异性体液免疫和细胞免疫应答。

中国HIV-1临床分离株感染性假病毒的构建及其中和特征分析

本研究从中国人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus-1, HIV-1)感染者血浆样本中分离和构建HIV-1 Envelope(Env)感染性假病毒,并分析其对单克隆广谱中和抗体的敏感性。采用逆转录和巢式PCR方法从感染者样本中扩增HIV-1 env基因,利用同源重组方法将env基因克隆至真核表达载体pVAX1中,包装HIV-1Env假病毒后使用TZM-bl/假病毒中和实验方法检测单克隆广谱中和抗体的中和能力,基于已有抗体的结构数据分析病毒逃逸中和抗体的关键突变位点。本研究从两个HIV-1感染者donor A和donor B中分别获得了8株和3株携带CRF07_BC亚型env基因的感染性假病毒;序列分析显示两组假病毒Env氨基酸同源性仅为83.2%~85.2%,存在一定的差异;11株假病毒对于VRC01和10E8中和抗体依旧敏感,而对于35O22和VRC34.01耐受;donor B来源的假病毒存在N133D和R170E突变而可能影响了PG16抗体的中和能力,donor A来源的假病毒可能由于携带了S291F和E336K突变而逃逸了VRC-PG05抗体,donorA来源的假病毒还可能通过G324E突变进一步影响PGT121中和抗体的活性。本研究成功获得了11株中国HIV-1 CRF07_BC亚型的Env假病毒,评估了临床分离株病毒对已有中和抗体的敏感性,揭示了病毒逃逸中和抗体的关键突变位点,为中国HIV-1感染者应用单克隆中和抗体治疗提供了选择依据,同时也丰富了HIV-1假病毒与中和抗体领域的研究。

从一名HIV-1感染者中分离出能中和2株Tier 2病毒的单克隆抗体

目的 从中国HIV-1感染者中分离和鉴定能够中和二级难中和（Tier 2）病毒的单克隆中和抗体.方法 单个B细胞流式分选和单克隆抗体表达技术获得单克隆抗体,免疫遗传学数据库分析抗体可变区基因,酶联免疫吸附试验测定抗体的结合能力,TZM-bl/假病毒中和试验测定抗体的中和能力.结果 从一个HIV-1 B亚型病毒感染者中分离到了E11和H2两个能够中和2株Tier 2病毒的单克隆中和抗体;E11和 H2抗体的重链基因均来源于 IGHV4-4＊08家系,突变率分别为15.79%和14.74%,轻链基因均来源于IGKV3-15＊01家系,突变率分别为8.33%和7.95%;两个抗体可与B亚型、CRF01_AE和CRF07_BC病毒蛋白结合;E11和H2抗体对398-F1病毒（Tier 2）的50%抑制浓度分别为18. 78 μg/ml 和22. 43 μg/ml,中和25710病毒（Tier 2）的浓度分别为43.35 μg/ml和39.45 μg/ml.结论 本研究成功分离到了两个能够中和2株Tier 2病毒的单克隆中和抗体,能够为相关艾滋病疫苗的设计提供研究基础.

抗人CD4 D1D2结构域多克隆抗体对HIV-1的抑制作用

目的研究抗人CD4DID2结构域多克隆抗体对HIV-1的抑制作用。方法经overlappingPCR构建人鼠嵌合型CD4质粒pcDNA3．1-mhD1D2m和pcDNA3．1-mhD2m，利用pcDNA3．1／V5-His—TOPO质粒载体的通用引物双向测序，测序结果用vectorNTI8．0软件与预期序列作比对，并通过假病毒感染实验检测其介导病毒感染能力，实验数据采用SPSS11．5统计学软件进行χ^2检验。pcDNA3．1-mhDID2m和pcD—NA3．1-mhD2m经DNA免疫BALB／c小鼠，所获多抗血清经假病毒中和实验检测其抗HIV-1中和能力，经FACS检测其与CD4抗原结合能力。结果所构建人鼠嵌合型CD4质粒pcDNA3．1-mhD1D2m能够介导HIV-1假病毒感染。质粒pcDNA3．1-mhD1D2m免疫小鼠8周后所获得的多抗血清稀释100倍后，对HIV-1毒株抑制率为76％～95％。质粒pcDNA3．1-mhD2m免疫小鼠所获得的多抗血清则无明显的中和作用。FACS检测显示mhD1D2m多抗血清与TZM-b1细胞表面的CD4可以特异性结合。结论抗人CD4D1D2结构域多克隆抗体对H1V-1具有较强的抑制作用，为AIDS治疗和疫苗研发提供实验依据。

自愿婚检人群血液传染性指标检测结果分析

目的:了解新的《婚姻登记条例》颁布实施以后自愿婚检人群中血液传染性指标的情况。方法:对5542例到我院自愿参加婚前医学检查人群的血液传染性指标如HBsAg、抗-HCV、梅毒、抗-HIV1/2进行检测。结果:自愿婚检人群HBsAg阳性率为8.4%,抗-HCV阳性率为0.34%,梅毒阳性率为0.43%,抗-HIV1/2阳性率为0.036%。结论:增强婚检保健意识,积极参加婚前检查,对提高人口素质、维护社会安定团结有积极意义。应同时使用TRUST法与TPPA法对梅毒螺旋体进行检测,减少漏诊、误诊,避免医疗纠纷。