早期肺腺癌组织中人天冬氨酸β-羟化酶、CD44V6的表达水平及临床意义

目的观察早期肺腺癌组织中人天冬氨酸β-羟化酶(ASPH)、CD44V6的表达情况,并分析其与临床病理特征及预后的关系。方法选取2016年10月-2022年6月烟台业达医院行手术治疗且完成3年随访的120例早期肺腺癌患者的癌组织标本,并根据组织分化程度另取配对的30例早期肺腺癌患者癌旁组织标本为对照。采用免疫组织化学法检测癌组织及癌旁组织中ASPH、CD44V6的表达情况。结果癌组织中ASPH、CD44V6阳性率均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。临床分期为ⅠB期、分化程度为低分化的早期肺腺癌患者癌组织中ASPH阳性表达率高于临床分期为ⅠA期、分化程度为中高分化的癌组织,差异有统计学意义(P<0.05);年龄≥60岁、临床分期为ⅠB期、分化程度为低分化的早期肺腺癌患者癌组织中CD44V6阳性表达率高于年龄<60岁、临床分期为ⅠA期、分化程度为中高分化的癌组织,差异有统计学意义(P<0.05)。经Somers′d检验结果显示,临床分期、分化程度与ASPH表达呈正相关(d>0,P<0.05);年龄、临床分期、分化程度与CD44V6表达呈正相关(d>0,P<0.05)。经卡方检验Phi系数显示,ASPH与CD44V6表达在早期肺腺癌中呈正相关(Phi=0.906,P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,ASPH与CD44V6阳性表达是早期肺腺癌患者预后不良的危险因素(OR>1,P<0.05)。受试者工作特征(ROC)曲线显示,ASPH、CD44V6预测早期肺腺癌患者预后的敏感度分别为0.960、0.920,特异度分别为0.284、0.242。结论早期肺腺癌组织中ASPH和CD44V6阳性表达率高;年龄、临床分期、分化程度与CD44V6阳性表达有关,临床分期、分化程度与ASPH阳性表达有关;ASPH、CD44V6表达与早期肺腺癌患者预后情况有关。

血清天冬氨酸-天冬酰胺β羟化酶表达与肝细胞癌术后患者预后的关系研究

目的探讨血清天冬氨酸-天冬酰胺β羟化酶(ASPH)表达与肝细胞癌(HCC)术后患者复发或死亡的关系。方法选取2010年6月—2011年1月于东南大学附属南京市第二医院肝胆外科收治的HCC患者96例为研究对象,记录患者病理分级、肿瘤直径、肝纤维化病理分期、TNM分期,以及有无门静脉癌栓、微血管浸润,检测入院时清蛋白、总胆红素水平。检测术前甲胎蛋白(AFP)、高尔基体蛋白73(GP73),以及术前及术后1周、1个月、2个月ASPH水平。以手术时间为观察起点随访5年,以肿瘤复发或死亡为观察终点事件。分别采用Log-rank检验、多因素Cox比例风险回归模型分析HCC术后患者预后的影响因素。结果 HCC患者术前及术后1周、1个月、2个月ASPH水平分别为(128.3±19.3)、(91.2±16.2)、(33.7±9.4)、(22.4±5.7)ng/L,术后2个月患者ASPH水平均在参考范围内。单因素分析显示,不同肿瘤直径、TNM分期,有无门静脉癌栓、微血管浸润,以及不同术前ASPH表达的HCC术后患者复发或死亡率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Cox比例风险回归模型分析显示,TNM分期〔HR=1.378,95%CI(1.124,1.842)〕、门静脉癌栓〔HR=1.260,95%CI(1.012,1.356)〕、微血管浸润〔HR=1.583,95%CI(1.144,2.652)〕、术前ASPH表达〔HR=1.475,95%CI(1.875,2.011)〕是HCC术后患者复发或死亡的影响因素(P<0.05)。结论术前ASPH表达是HCC术后患者复发或死亡的独立影响因素,可作为判断HCC术后患者预后的潜在指标。

膜联蛋白A3、天冬氨酸β-羟化酶与乳腺癌患者紫杉醇耐药的相关性分析

目 的探讨膜联蛋白A3(annexin A3,ANXA3)、天冬氨酸β-羟化酶(aspartateβ-hydroxylase,ASPH)与乳腺癌患者紫杉醇(paclitaxel,PTX)耐药的相关性。方法 选取2020年2月至2021年2月中国人民解放军联勤保障部队第九六○医院淄博医疗区收治的74例女性乳腺癌患者作为研究对象,根据是否发生PTX耐药将其分为PTX耐药组(23例)和无PTX耐药组(51例),检测其乳腺癌组织中ANXA3、ASPH的表达水平。比较两组患者的临床资料并分析影响乳腺癌PTX耐药的因素。结果 单因素分析结果显示,T分期、N分期以及细胞周期调节蛋白D1(cell cycle regulatory protein D1,Cyclin D1)、ANXA3、ASPH阳性表达是影响乳腺癌患者PTX耐药的因素(P<0.05);多因素logistic回归分析结果显示,ANXA3阳性表达(OR=3.077,95%CI 1.104~8.577)、ASPH阳性表达(OR=1.548,95%CI1.149~2.085)是乳腺癌患者PTX耐药的独立影响因素(P<0.05);ANXA3、ASPH表达与Cyclin-D1的表达有关(P<0.05)。结论 ANXA3、ASPH高表达是乳腺癌患者PTX耐药的独立影响因素,可作为乳腺癌患者PTX耐药的重要评估指标之一。

天冬氨酰-(天冬酰胺酰)β- 羟化酶在肿瘤中的作用 研究进展

人类天冬氨酰-(天冬酰胺酰)β-羟化酶(aspartyl/asparaginylβ-hydroxylase,ASPH,AAH)是一种高度保守的脱氧酶,属于α-酮戊二酸依赖型双加氧酶家族,可在二价铁存在的条件下羟化多种蛋白质(如Notch)和表皮细胞生长因子样结构域的天冬氨酸或天冬酰胺残基,参与一系列癌症相关通路,从而在细胞生长、分化及运动中发挥重要作用。ASPH在多种恶性肿瘤中过表达,参与并调节恶性肿瘤细胞的侵袭及转移,并可介导抗肿瘤免疫反应,在肿瘤靶向治疗、免疫治疗中的作用逐渐受到重视。本文综述了近年来ASPH在各系统肿瘤中的相关研究成果,旨在为探寻新的肿瘤防治策略提供参考。

人天冬氨酸-β-羟化酶树突状细胞疫苗对肝癌细胞系的体外作用研究

目的:通过对携带人天冬氨酸-β-羟化酶(aspartate-β-hydroxylase,AAH)基因的树突状细胞杀伤肝癌细胞系的研究,探索可用于防治肝癌的树突状细胞疫苗。方法:重组腺病毒(Ad-AAH-IRES2-EGFP)感染C57BL/6小鼠骨髓未成熟树突状细胞(dendritic cells,DCs)制备携带AAH基因的DCs(AAH-DCs),与同体小鼠脾脏T淋巴细胞共培养后作为效应细胞,以肝癌细胞株HepG2和Huh7分别作为靶细胞,效应细胞分别和靶细胞共培养24 h,CCK-8法检测效应细胞对靶细胞增殖的影响;流式细胞术检测效应细胞对靶细胞凋亡的影响。将AAH-DCs连续3次皮下注射免疫C57BL/6小鼠,乳酸脱氢酶释放法检测免疫后小鼠脾脏T淋巴细胞对靶细胞的裂解效应。结果:AAH-DCs与T淋巴细胞共培养组靶细胞的增殖能力明显低于对照组(P=0.000),凋亡率明显高于对照组(P=0.000);实验组靶细胞的裂解率明显高于对照组(P=0.000)。结论:荷载AAH基因的树突状细胞疫苗能够诱导产生细胞毒性T淋巴细胞从而杀伤表达AAH的肝癌细胞。

丹皮酚通过调控动脉粥样硬化中的miR-152-3p/ASPH轴抑制氧化低密度脂蛋白诱发的小鼠血管内皮细胞凋亡、炎症反应和氧化应激

目的揭示丹皮酚通过调控miR-152-3p/ASPH轴在ox-LDL诱导的血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)进展中的作用。方法首先,用不同浓度的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)(0、25、50、100μg·mL^(-1))处理小鼠VECs,选取100μg·mL^(-1)ox-LDL进行实验。然后,用不同浓度的丹皮酚(30、60、120μmol·L^(-1))或辛伐他汀(30μmol·L^(-1))处理VECs。接着,使用细胞计数试剂盒-8和流式细胞术分别用于测定细胞活力和凋亡。此外,使用酶联免疫吸附法分析了IL-1β和IL-6的水平,并使用相关试剂盒检测了活性氧、乳酸脱氢酶和丙二醛的含量。此外,通过qRT-PCR或Western blot检测miR-152-3p和天冬氨酰(天冬酰胺)β-羟化酶(aspartate-β-hydroxylase,ASPH)的表达。miR-152-3p和ASPH之间的相互作用由starBase预测,然后通过双荧光素酶报告基因实验和RNA结合蛋白免疫沉淀实验证实。结果100μg·mL^(-1)ox-LDL显著抑制VECs活力,并促进细胞凋亡、炎症反应和氧化损伤。而丹皮酚的处理以剂量依赖性的方式增加细胞活力,抑制ox-LDL诱导的细胞凋亡。丹皮酚以剂量依赖性的方式降低ox-LDL诱导的IL-1β和IL-6的水平,以及以剂量依赖性的方式减弱ox-LDL对ROS、MDA和LDH含量的促进作用。另外,ox-LDL对miR-152-3p表达的抑制作用和对ASPH表达的促进作用也被丹皮酚逆转,且120μmol·L^(-1)丹皮酚效果最好。120μmol·L^(-1)丹皮酚能够上调miR-152-3p或下调ASPH,进一步促进丹皮酚对VECs生长的保护作用,miR-152-3p靶向负调控ASPH表达。结论丹皮酚通过调节miR-152-3p/ASPH轴减弱ox-LDL对小鼠VECs生长的影响,为AS的治疗提供理论基础。

人类天冬胺酰基β-羟化酶的表达及其单克隆抗体的制备

旨在深入研究人类天冬胺酰基β-羟化酶(HAAH)在肿瘤早期诊断中的作用机制。应用RT-PCR方法从肝癌组织中获得人类天冬胺酰基β-羟化酶HAAH编码基因,并在原核表达载体pBV-IL1中进行融合表达,将Ni柱纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,获得了3株稳定的阳性单克隆细胞株(H3/E10、E4/F12、G4/D8),间接ELISA和Western blotting鉴定单抗的特异性和灵敏度,以单抗H3/E10介导的间接免疫荧光检测HAAH在各种肿瘤细胞系中的表达,可见特异的荧光。试验中成功构建了可表达HAAH基因的原核表达载体pBV-IL1-HAAH,并制备了3株抗HAAH的单克隆抗体,为HAAH的结构和功能的研究奠定了基础,同时也为进一步将该抗体应用于肿瘤的早期诊断以及研究HAAH在肿瘤发生转移中的机理提供了重要工具。

TAp63对MPP^(+)处理的SH-SY5Y细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9和酪氨酸羟化酶表达的影响

目的探讨TAp63基因表达水平对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP^(+))诱导的帕金森病(PD)细胞模型细胞活性、酪氨酸羟化酶(TH)和凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)的影响。方法将小鼠神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞系)依据不同处理方法分为6组:(1)对照组,无任何干预措施;(2)MPP^(+)处理组,MPP^(+)10μmol·L^(-1)处理24 h;(3)TAp63-NC组,用携带无义序列的慢病毒颗粒转染48 h;(4)TAp63-NC+MPP^(+)组,用携带无义序列的慢病毒颗粒转染48 h后,加MPP^(+)10μmol·L^(-1)处理24 h;(5)TAp63过表达组,用携带过表达TAp63基因的慢病毒颗粒转染48 h;(6)TAp63过表达+MPP^(+)组,用携带过表达TAp63基因的慢病毒颗粒转染48 h,换液后予以MPP^(+)10μmol·L^(-1)处理24 h。采用CCK-8法检测6组细胞的存活率;Western blot法检测TAp63、TH、caspase-9表达水平。结果CCK-8检测显示,与对照组比较,MPP^(+)组细胞活性显著下降(P<0.01)。与TAp63-NC+MPP^(+)组比较,TAp63过表达+MPP^(+)组细胞存活率升高,差异有显著统计学意义(P<0.001)。Western blot检测显示:与对照组比较,MPP^(+)组的TAp63蛋白和TH蛋白表达量降低,而caspase-9表达量升高(均P<0.05);与TAp63-NC+MPP^(+)组比较,TAp63过表达+MPP^(+)组TAp63蛋白和TH蛋白表达量升高,而caspase-9蛋白表达水平降低(均P<0.05)。结论TAp63基因过表达可提升MPP^(+)诱导的PD细胞的存活率,提高TH表达量,降低caspase-9表达水平,进一步发挥其潜在的神经保护作用。

血清天冬氨酸-天冬酰胺β羟化酶(ASPH)分子联合AFP和GP73检测对原发性肝癌的诊断意义

目的探讨联合检测血清天冬氨酸-天冬酰胺β羟化酶(ASPH)、甲胎蛋白(AFP)以及高尔基体糖蛋白73(GP73)对于原发性肝癌的诊断意义。方法分别检测50例原发性肝癌患者、50例肝炎肝硬化患者和50例健康人血清中AFP、GP73和ASPH的含量,分析ASPH联合AFP、GP73检测对原发性肝癌的诊断意义。结果肝炎肝硬化组和健康对照组AFP、GP73和ASPH含量明显低于原发性肝癌组,差异有统计学意义(P<0.05);单独检测AFP、GP73和ASPH对诊断原发性肝癌的灵敏度分别为76.00%、86.00%和80.00%,特异度分别为88.00%、98.00%、86.00%,准确度分别为82.00%、92.00%、87.00%;GP73灵敏度、特异度及准确度均为三项中最高。联合检测AFP、GP73和ASPH三项灵敏度为96.00%,特异度为98.00%,准确度为97.00%,均高于单项检测。结论联合检测AFP、GP73和ASPH可作为诊断原发性肝癌的重要指标,可提高早期原发性肝癌的诊断率。

天冬氨酰-β-羟化酶、缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子在稽留流产绒毛中的表达及意义

目的探讨天冬氨酰-β-羟化酶(AAH)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)在正常早孕及稽留流产绒毛组织中的表达及意义。方法选取正常早期妊娠孕妇80例(对照组)、稽留流产孕妇120例(研究组),并按照胚胎在宫内停育时间将120例稽留流产组分为<2周组和≥2周组。分别用免疫组化法检测两组绒毛组织中AAH、HIF-1a、VEGF的表达。结果研究组AAH、HIF-1α和VEGF的阳性表达率分别为90.8%、87.5%和72.5%,对照组均阳性表达(P<0.05)。在<2周组AAH、HIF-1α和VEGF中阳性表达率分别为89.6%、85.4%和72.9%,≥2周组分别为91.7%、97.2%和72.2%,两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 AAH、HIF-1a、VEGF在稽留流产患者绒毛中表达明显低于正常早孕绒毛中的表达,其低表达可能是导致稽留流产的发生的重要因素。

天冬氨酰-(天冬酰胺酰)β-羟化酶在肝癌中的作用研究进展

肝细胞癌的发病率逐年上升,且伴有较高的术后复发及转移率,但其机制尚未明确。最初研究发现天冬氨酰-(天冬酰胺酰)β-羟化酶(Aspartyl/Asparaginyl beta-hydroxylase, ASPH, AAH)在肝癌和胆管细胞癌中表达增加,且与肝细胞癌的多种生物学行为相关。本文综述了近年来有关ASPH在肝细胞癌中的作用的相关研究,以期为其治疗提供新的理论依据。

天冬氨酸β-羟化酶mRNA在乳腺癌中的表达及与临床病理、预后的关系分析

目的探讨天冬氨酸β-羟化酶(aspartateβ-hydroxylase,ASPH)mRNA在乳腺癌中的表达及与临床病理、预后的关系。方法选取2015-01/2019-01月收治的156例乳腺癌患者。获取患者乳腺癌手术切除的病理组织标本,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测癌组织以及癌旁组织的ASPH mRNA表达水平。收集患者临床资料并预后随访。结果乳腺癌组织的ASPH mRNA表达水平高于癌旁组织(P<0.05)。乳腺癌组织ASPH mRNA表达水平与TNM分期、T分期、N分期、组织学分级有关联(P<0.05);与年龄、肿瘤象限、分子分型、乳腺癌家族史无明显关联(P>0.05)。ASPH mRNA高表达患者存活57例(73.08%),死亡21例(26.92%),生存期为26~72个月。ASPH mRNA低表达患者存活70例(89.74%),死亡8例(10.26%),生存期为34~72个月,两组生存曲线比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论ASPH mRNA与乳腺癌临床分期密切相关,ASPH mRNA高表达导致患者不良预后。

人ASPH基因修饰树突状细胞介导CTLs对肝癌细胞系SMMC-7721的体外杀伤作用

目的:探索人天冬氨酸-β-羟化酶(aspartateβ-hydroxylase,ASPH)基因修饰的树突状细胞(dendritic cells,DCs)诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)对肝癌细胞系SMMC-7721的体外杀伤效应。方法:重组腺病毒(Ad-ASPHIRES2-GFP)感染C57BL/6小鼠骨髓未成熟树突状细胞(immature DCs,im DCs)制备DCs疫苗,分为3组:含人ASPH基因的重组腺病毒感染im DCs组(DCs-ASPH组)、空腺病毒感染im DCs组(DCs-GFP组)和im DCs组,Western blot和q RT-PCR检测ASPH蛋白和m RNA在各组DCs中的表达,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测感染前后小鼠DCs表面标志物CD80、主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)和CD11c表达量。DCs疫苗诱导产生CTLs后与肝癌细胞系SMMC-7721共培养,采用CCK-8法和FCM分别检测其对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。ELISA检测CTLs上清液中IFN-γ含量。结果:成功培养出DCs并制备DCs疫苗,人ASPH基因修饰的DCs表面标志物CD80、MHC-Ⅱ和CD11c显著高于DCs-GFP组(P=0.000)和im DCs组(P=0.000)。人ASPH基因修饰的DCs诱导的CTLs组SMMC-7721细胞的增殖能力显著低于DCs-GFP组和im DCs组(P=0.000)、凋亡率明显高于DCs-GFP组和im DCs组(P=0.000),DCs-ASPH组诱导的CTLs上清液中IFN-γ显著高于DCs-GFP组和im DCs组(P=0.000)。结论:人ASPH基因修饰的DCs疫苗体外诱导产生的CTLs能够明显抑制肝癌细胞SMMC-7721增殖并促进其凋亡。

抑制p38MAPK通路对帕金森病模型小鼠黑质BAD和caspase-3表达的影响

目的研究p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路对亚急性帕金森病(PD)模型小鼠中脑黑质Bcl-xl/Bcl-2死亡相关因子(BAD)和半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达调控作用,探讨PD中脑黑质多巴胺(DA)能神经元进行性变性丢失的可能机制。方法健康雄性C57BL/6N小鼠45只,随机分为3组,(1)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)模型组:腹腔注射MPTP(30 mg/kg,溶于生理盐水),1次/d,连续5 d;(2)抑制剂组:在每次MPTP注射前1 h腹腔注射SB203580(10 mg/kg,溶于5mg/ml DMSO)1次/d,连续5 d;(3)对照组:注射与模型组和抑制剂组等量的生理盐水和DMSO。观察模型小鼠行为学变化,中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)、BAD、caspase-3和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)的表达变化,及给予p38MAPK通路特异性抑制剂SB203580对上述表达变化的影响。结果模型小鼠出现典型的PD行为学症状,中脑黑质区TH阳性神经元和蛋白水平分别下降约60%和65%(P<0.01),p-p38MAPK、BAD和caspase-3阳性细胞数及蛋白水平显著增加(P<0.01);经p38MAPK特异性抑制剂SB203580处理后,PD小鼠行为学症状改善,TH阳性神经元和蛋白水平下降程度明显减轻;中脑黑质BAD、caspase-3和p-p38MAPK阳性细胞数显著减少,蛋白水平下降明显(P<0.01)。结论p38MAPK通路在亚急性PD模型小鼠黑质BAD和caspase-3表达中可能有重要调控作用,p38MAPK通路特异性抑制剂SB203580对PD小鼠具有一定的神经保护作用。

HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA表达变化及其与血浆IFN-α水平的相关性

目的观察人类免疫缺陷病(HIV-1)感染者外周血单个核细胞(PBMC)中不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(SAMHD1)mRNA变化及其与血浆干扰素(IFN-α)水平的相关性。方法 HIV-1感染者78例,其中32例未接受抗病毒治疗(未治疗组),46例接受高效抗逆转录病毒治疗1 a以上(治疗组),另选28例健康体检者作对照(对照组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测PBMC中SAMHD1 mRNA,采用人IFN-αELISA检测试剂盒检测血浆IFN-α,采用Pearson相关分析法分析HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA与外周血IFN-α水平的相关性。结果与对照组比较,未治疗组和治疗组PBMC中SAMHD1 mRNA、外周血IFN-α水平升高(P均<0.01);与未治疗组比较,治疗组HIV病毒载量降低,CD+4T细胞数增加(P均<0.05)。HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA与病毒载量、CD+4T细胞数量无相关性(r分别为-0.306、0.064,P均>0.05),与血浆IFN-α水平呈正相关(r=0.324,P<0.05)。结论 HIV-1感染者外周血PBMC中SAMHD1 mRNA升高,其与外周血IFN-α水平相关;HIV-1的感染会上调SAMHD1 mRNA水平,其机制可能是通过IFN-α的调节实现的。

肝癌患者血清ASPH、5'-NT含量与血管新生、癌细胞增殖的相关性

目的:研究肝癌患者血清ASPH、5'-NT含量与血管新生、癌细胞增殖的相关性。方法:选择在本院接受手术切除的原发性肝癌患者作为研究的肝癌组,同期在榆林市第三医院体检的健康志愿者作为研究的对照组。采集两组受试者的血清并检测ASPH、5'-NT及癌细胞增殖分子的含量;采集肝癌组患者的肝癌病灶、癌旁病灶并检测血管新生分子、癌细胞增殖分子的含量。结果:肝癌组血清中ASPH、5'-NT的含量均显著高于对照组;肝癌病灶中VEGF、VEGFR1、VEGFR2、HGF、EGFR、Bcl-2、Bcl-x、Bclw的含量均显著高于癌旁病灶且与肝癌患者血清中ASPH、5'-NT的含量呈正相关,肝癌病灶中Bax、Bak的含量显著低于癌旁病灶与肝癌患者血清中ASPH、5'-NT的含量呈负相关;肝癌组血清中AFP、GP73、GPC3、DKK1的含量显著高于对照组与肝癌患者血清中ASPH、5'-NT的含量呈正相关。结论:肝癌患者的血清ASPH、5'-NT含量显著升高且能准确评估血管新生及癌细胞增殖。

鼠源性抗人HAAH mAb可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的:从分泌抗人类天冬氨酰基β-羟化酶(HAAH)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞G3/F11中,克隆出鼠源an-ti-HAAH mAb重、轻链可变区基因,构建Anti-HAAH的单链抗体(scFv),并进行scFv基因的蛋白表达。方法:提取杂交瘤细胞G3/F11的总RNA,通过RT-PCR扩增出VH和VL基因;再利用重叠延伸PCR(SOE-PCR),通过设计在引物上的linker序列,将VH和VL拼接为完整anti-HAAHscFv基因。将测序正确的scFv基因克隆入pHEN1载体,并利用E.coliHB2151进行蛋白表达;通过SDS-PAGE,Western blot分析其表达状况,ELISA鉴定其抗原结合活性。结果:测序结果显示,本实验成功地构建出鼠源anti-HAAHVH-linker-VLscFv基因,且VH、VL均具有完整正确的小鼠抗体骨架区和互补决定区结构,所得的scFv基因片段全长744bp,编码248个氨基酸。SDS-PAGE和Westernblot分析表明,pHEN1-anti-HAAH在E.coliHB2151可表达为Mr约27000的可溶性scFv蛋白,表达量为7.8%。间接ELISA检测显示,可溶性鼠源anti-HAAHscFv蛋白具有较高的抗原结合活性。结论:成功扩增出的鼠源anti-HAAHmAbVH区和VL区基因,并构建为anti-HAAHscFv基因。然后,利用pHEN1载体对anti-HAAHscFv基因进行成功表达,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础。

胸水细胞蜡块中ASPH表达在非小细胞肺癌诊断中的应用价值

目的探讨人天冬胺酰基β-羟化酶(human aspartyl/asparaginylβ-hydroxylase,ASPH)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)胸水细胞中的表达及应用价值。方法收集80例NSCLC及20例非癌胸水标本制作细胞蜡块检测ASPH蛋白表达,并与其他常用肺癌诊断标志物对比,分析其与临床病理特征的关系及用于诊断NSCLC的敏感性和特异性。结果ASPH在NSCLC胸水癌细胞阳性表达率高于非癌胸水(91.3%VS 0%,P<0.01),但无组织学特异性;②ASPH诊断腺癌的阳性率高于TTF1(90.9%VS 81.3%)和NapsinA(90.9%VS 77.5%),诊断鳞状细胞癌阳性率与P40相同(100%);③胸水细胞ASPH表达在肿瘤分化程度、淋巴结转移及其他脏器转移不同组别中差异有统计学意义(P<0.05),在性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、胸膜累及、组织学类型等不同组别中差异无统计学意义(P>0.05),ASPH阴性组较阳性组中位生存期更长(10个月VS 5个月)。结论ASPH在NSCLC胸水细胞中高表达,结合其他经典诊断标志物有助于提高胸水细胞学阳性率,ASPH高表达与预后不良相关,具有一定的临床应用价值。

稽留流产患者绒毛滋养细胞AAH的表达

目的:研究天冬氨酰-(天冬酰胺酰)β-羟化酶(AAH)在稽留流产患者及正常早孕妇女绒毛组织中的表达定位及差异。方法:选取经B超及β-HCG动态监测证实为稽留流产患者50例作为研究组,其中有已知可能原因者20例为研究组1,未知原因者30例为研究组2。选取同期经B超证实胚胎存活,在门诊要求行人工流产的早孕妇女20例作为对照组。根据稽留宫内时间长短不同将研究组分为≤4周组和>4周组。应用免疫组织化学方法比较各组绒毛滋养细胞中AAH的表达。结果:AAH在稽留流产患者及正常早孕妇女绒毛组织滋养细胞胞浆及胞核表达,稽留流产患者绒毛滋养细胞中AAH表达明显低于正常早孕妇女(P<0.05)。有已知原因及未知原因稽留流产患者之间AAH表达无显著差异(P>0.05)。稽留流产患者胚胎稽留宫内时间长短不同,AAH表达亦无显著差异(P>0.05)。结论:AAH在滋养细胞胞浆及胞核中的低表达可能导致稽留流产的发生。

抑制EZH2表达对宫颈癌细胞凋亡的影响及机制

目的观察抑制人类Zest同源增强子(EZH2)表达对宫颈癌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。方法选择人宫颈癌细胞系Siha和C33A细胞,采用MTT法确定EZH2抑制剂3-去氮腺嘌呤(DZNep)在两种细胞中的半数抑制浓度(IC_(50))。将两种细胞分为DMSO组、1/2 IC_(50)组和IC_(50)组,分别以DZNep终浓度0、3、6μmol/L处理Siha细胞各组,以0、2、4μmol/L处理C33A细胞各组。培养48 h后收集各组细胞,采用流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况,采用Western blotting法检测EZH2蛋白、抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-X基因长片段(Bcl-xL)、促凋亡蛋白Bcl-2家族细胞凋亡相互作用因子(Bim)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达。结果在Siha、C33A细胞中,1/2 IC_(50)组、IC_(50)组早期凋亡率均高于DMSO组,IC_(50)组早期凋亡率均高于1/2 IC_(50)组(P均<0. 05)。IC_(50)组EZH2蛋白表达均低于1/2 IC_(50)组、DMSO组(P均<0. 05); IC_(50)组Bcl-xL蛋白表达均低于1/2 IC_(50)组、DMSO组,Bim和Caspase-3蛋白表达均高于1/2 IC_(50)组、DMSO组(P均<0. 05)。结论利用DZNep抑制宫颈癌细胞EZH2的表达后,能够诱导宫颈癌细胞早期凋亡,其机制可能与下调Bcl-xL蛋白表达并上调Bim和Caspase-3蛋白表达有关。