成胶质细胞瘤U87干细胞样细胞的培养及其代谢表型与成瘤能力鉴定

目的培养成胶质细胞瘤U87干细胞样细胞(U87 SLCs),检测其干性标志物的水平、线粒体呼吸能力和体内成瘤能力。方法DMEM/F-12中添加B-27以及生长因子EGF和bFGF作为无血清干细胞培养基培养U87 SLCs;悬浮培养U87 SLCs使用神经球培养法,贴壁培养U87 SLCs通过在培养表面包被Matrigel基质胶实现;通过RT-qPCR和Western blot检测培养物的干性标志物mRNA和蛋白质水平;通过流式细胞测量术检测培养物中CD133+细胞的比例;通过Seahorse实时细胞代谢分析检测细胞耗氧速率的变化;通过接种动物皮下移植瘤验证细胞成瘤能力的改变。结果干细胞培养基中的U87 SLCs在1周内即会成长为典型的细胞球形态,细胞球在培养过程中会不断增大;在贴壁剂合适的浓度下,U87 SLCs可以在干细胞培养基中完好地平铺贴壁增殖;CD133、nestin、OLIG2、CD44、CD15、整合素α6(ITGA6)等干性标志物的mRNA表达水平在两种方式培养后与U87相比均显著提升(P<0.05),CD133和nestin的蛋白水平在两种方式培养后也均升高(P<0.05);U87 SLCs展现出了更高的线粒体储备呼吸能力(P<0.05);U87 SLCs能够以更少的接种细胞数形成更大的皮下肿瘤(P<0.05),U87 SLCs体内增殖更加迅速,具有更强的成瘤能力。结论U87 SLCs具有典型的干性特征,是一个良好的干性更高的肿瘤细胞模型。

槐定碱抑制U251恶性胶质瘤细胞株增殖和侵袭及机制研究

探讨槐定碱抑制U251恶性胶质瘤细胞株增殖和侵袭及机制。方法 根据实验方式进行分组,分为对照组、槐定碱组、氯喹+槐定碱组。对槐定碱抑制U251恶性胶质瘤细胞株增殖、侵袭能力、迁移能力及活性氧蛋白水平激发情况进行分析,其中细胞增殖的抑制作用利用MTT法检测、侵袭能力利用Transwell小室法检测、细胞的迁移能力利用细胞划痕试验检、活性氧蛋白水平利用Western-blot法检测。结果 与对照组中的超微结构结构相比,U251恶性胶质瘤细胞株在经过槐定碱处理后,其胞质中出现大小不等的自噬体,而这部分自噬体中含有溶酶体、胞质等未消化的细胞器。MTT法检测发现在使用槐定碱试剂进行干预后,槐定碱组中槐定碱对U251恶性胶质瘤细胞生长的半数抑制浓度为(16.45±2.41),高于氯喹+槐定碱组的(2.67±0.56)及对照组的(1.01±0.03);通过Transwell小室检测细胞迁移率发现槐定碱组低于氯喹+槐定碱组及对照组(P<0.05);LC3Ⅱ/Ⅰ、活性氧水平分析中槐定碱组高于氯喹+槐定碱组及对照组(P<0.05);同时Person相关性分析提示活性氧与细胞中呈正相关性(r=0.431,P<0.05)。结论 通过分析发现,槐定碱能够通过调节、诱导自噬来抑制U251恶性胶质瘤细胞株增殖、侵袭、迁移,并涉及细胞中活性氧水平的改变。

人类巨细胞病毒感染对神经胶质瘤细胞HOXB5,HOXB6,HOXB7及HOXB8基因表达的影响

以半定量RT -PCR技术检测经人类巨细胞病毒 (HCMV)感染和 /或全反式维甲酸 (ATRA)处理的神经胶质瘤细胞U2 5 1株的HOXB5 ,HOXB6 ,HOXB7和HOXB8的相对表达水平 ,以探讨HCMV致畸的可能机制。结果示 ,未经处理的U2 5 1细胞不表达HOXB5 ,HOXB6及HOXB8,但表达HOXB7;HCMV感染和 /或ATRA处理后 ,细胞仍不表达HOXB5及HOXB6 ,但在第二代时均表达HOXB8,尤以HCMV和ATRA共同处理后更明显 ;第三代后HOXB8的表达恢复正常。HCMV和 /或ATRA处理细胞后 ,HOXB7的表达在第一代即上调 ,第二代、第三代其表达稍下降 ,至第四代时表达又上调。表明HCMV致畸作用可能是通过诱导HOX基因的表达进而调节其它基因的异常表达而实现。

人类疱疹病毒6A亚型DR7基因对神经胶质瘤细胞U87增殖、迁移、侵袭能力的影响

目的:构建含人类疱疹病毒6A亚型DR7基因的慢病毒,研究DR7基因表达对神经胶质瘤细胞U87增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法:PCR扩增DR7基因,克隆至慢病毒载体pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP,构建pLenti6.3-DR7-IRES2-EGFP重组慢病毒载体,经293T细胞包装重组病毒转染至神经胶质瘤细胞U87,经blasticidin筛选建立稳定表达株,通过细胞增殖实验、细胞周期实验、细胞划痕及Transwell实验研究稳定表达DR7基因对U87细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果:成功构建了pLenti6.3-DR7-6×His-IRES2-EGFP慢病毒表达载体,筛选了稳定表达DR7基因的U87-DR7-EGFP细胞株,CCK-8细胞增殖实验显示,稳定表达DR7基因的U87-DR7-EGFP细胞与阴性对照细胞U87-NC-EGFP、U87细胞相比,细胞增殖活性明显增高,差异具有统计学意义(P<0.001)。细胞周期检测发现U87-DR7-EGFP细胞S、G2/M期细胞所占比例多于U87-NC-EGFP、U87细胞:S期的比例分别为(34.73±1.12)%、(24.89±0.93)%、(25.39±0.96)%,差异具有统计学意义(P<0.001);G2/M期分别为(17.35±1.61)%、(11.36±1.50)%、(13.17±1.95)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验表明,U87-DR7-EGFP细胞愈合能力明显强于U87-NC-EGFP、U87细胞,划痕6 h愈合率分别为:(33.55±2.83)%、(23.50±3.18)%、(22.03±1.47)%,差异具有统计学意义(P<0.01);划痕12 h愈合率分别为(70.50±5.39)%、(53.60±4.67)%、(55.09±2.83)%,差异具有统计学意义(P<0.001)。Transwell实验表明,U87-DR7-EGFP细胞的穿膜数量明显多于U87-NC-EGFP、U87细胞,分别为:(543.00±22.94)、(387.00±15.63)、(412.00±20.30)个,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论:人类疱疹病毒6A亚型DR7基因表达能在体外促进人神经胶质瘤细胞U87增殖、迁移及侵袭,提示其在神经胶质瘤的发生和发展中可能起一定作用。

成纤维细胞激活蛋白α在神经胶质瘤中的表达及临床意义

目的:探讨成纤维细胞激活蛋白α(FAP-α)在神经胶质瘤组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系。方法:应用免疫组织化学法检测33例神经胶质瘤和7例正常对照脑组织中FAP-α蛋白的表达,并结合临床病理资料进行分析。同时对所有病例进行随访,分析FAP-α表达与患者预后的关系。进一步检索脑肿瘤分子数据库(Rembrandt)探讨FAP m RNA表达与预后的关系。结果:低级别胶质瘤和高级别胶质瘤之间FAP-α蛋白的积分光密度值(IOD)差异有统计学意义(P<0.01),且与胶质瘤病理分级存在正相关(r=0.673,P<0.01)。7例正常脑组织FAP-α蛋白不表达或表达弱阳性,与低级别胶质瘤(P<0.05)和高级别胶质瘤(P<0.01)比较差异有统计学意义。FAP-α蛋白的表达强度与患者性别、肿瘤大小、年龄以及手术切除程度无明显相关性(P>0.05)。生存分析显示FAP-α低表达组和高表达组生存率差异有统计学意义(P<0.01),FAP-α的表达是影响胶质瘤患者预后的独立因素(P<0.05)。检索脑肿瘤分子数据库,发现FAP m RNA低表达预后明显好于高表达(P<0.01)。结论:FAP-α在神经胶质瘤中存在表达,且与神经胶质瘤的病理分级正相关,其高表达可能提示不良预后。

三氧化二砷对体外人胶质瘤细胞株U251的影响

目的探讨三氧化二砷(As2O3)对体外培养的人类成神经胶质瘤细胞株U251MG的作用及其机制。方法应用倒置相差显微镜、四甲基偶氮唑蓝法、流式细胞仪,分别对不同浓度加药组及对照组U251细胞的存活、形态学改变、细胞DNA含量的分布进行观察和测定。结果0.5～4μmol/L的As2O3可明显抑制U251的增殖。流式细胞仪分析显示,加药组在G1期细胞前均出现亚二倍体峰,且G0/G1期细胞减少,诱导细胞凋亡。结论As2O3能抑制体外人胶质瘤细胞株U251的增殖,有望用于神经胶质瘤的治疗。

HCMV感染对人神经胶质瘤细胞HOXB1～4及HOXB9基因表达影响的研究

目的 研究人神经胶质瘤U2 5 1细胞株的HOXB基因表达状态及人类巨细胞病毒 (HCMV)感染对U2 5 1细胞HOXB1,HOXB2 ,HOXB3,HOXB4及HOXB9基因表达的影响 ,以探讨HCMV致畸的可能机制。方法 应用半定量逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)技术检测U2 5 1细胞感染HCMV和 /或全反式维甲酸 (ATRA)处理前后HOXB1,HOXB2 ,HOXB3,HOXB4和HOXB9基因的相对表达水平。结果 U2 5 1细胞表达HOXB1,HOXB2 ,HOXB3,HOXB4及HOXB9基因 ;HCMV感染后 ,U2 5 1细胞HOXB1基因表达明显上调 ,HOXB2和HOXB4基因表达轻微上调 ,HOXB3基因于HCMV感染后表达被抑制 ,HOXB9基因的表达在HCMV感染后不同时间无明显变化 ;ATRA能显著上调HCMV感染后U2 5 1细胞HOXB1基因的表达。结论 HCMV感染能诱导U2 5 1细胞HOXB基因表达改变 ,HCMV有可能通过调控HOXB基因表达异常引起胚胎发育畸形。

一种胶质瘤相关的酸性成纤维细胞生长因子mRNA同源物

目的 克隆胶质瘤相关基因 .方法 取胶质瘤患者新鲜肿瘤标本及肿瘤附近正常脑组织提取 m RNA,反转录成c DNA.采用基于 PCR的消减杂交法获得差异的 c DNA,并经多聚酶链反应扩增后克隆入 T载体测序 .用打点杂交法验证差异克隆 .结果 获得一胶质瘤相关的酸性成纤维生长因子基因同源物 .结论 该酸性成纤维生长因子基因同源物是酸性成纤维生长因子 m RNA的不同拼接产物 ,可能参与胶质瘤的形成 .

siRNA靶向沉默成纤维细胞激活蛋白α对胶质瘤细胞U87增殖的影响

目的 :探讨小分子干扰RNA(siRNA)靶向沉默成纤维细胞激活蛋白α(FAP-α)表达对神经胶质瘤细胞株U87增殖的影响。方法:实验分为空白对照组(Blank组)、阴性对照组(NC组)和siRNA组,通过脂质体将siRNA转染至胶质瘤细胞株U87,使用Western blot法检测FAP-α基因的蛋白水平,同时检测NC组和siRNA组Bcl-2、caspase-3的表达变化,使用Real-time PCR法检测FAP-α和增殖核抗原(PCNA)的mRNA水平,CCK-8法评价转染后NC组和siRNA组细胞的增殖能力。结果:①转染48 h后,siRNA组细胞FAP-αmRNA、蛋白的表达明显低于NC组和Blank组,差异有统计学意义(P<0.01),siRNA组较NC组caspase-3蛋白表达增加(P<0.05);Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.01),siRNA组较NC组PCNA mRNA表达明显下降(P<0.01)。②转染后48、72和96 h siRNA组U87细胞吸光度值低于NC组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:应用siRNA沉默FAP-α基因的表达,可以抑制胶质瘤细胞U87的增殖,诱导胶质瘤细胞的凋亡。

成胶质细胞瘤与PTEN基因及NCAM的关系

目的 :研究成胶质细胞瘤中PTEN基因突变及NCAM(神经细胞粘附分子 )的表达 ,并探讨与两者之间的关系。方法 :对 10 2例胶质瘤石蜡切片PTEN基因进行PCR SSCP分析 (聚合酶链反应 单链构象多态性分析 ) ,检测PTEN基因突变 ;同时通过免疫组化方法检测NCAM在胶质瘤中的表达。结果 :共有 11例成胶质细胞瘤发生PTEN基因突变 ,突变发生率为 2 6% ( 11 4 2 ) ,显著高于其它胶质瘤 ( χ2 =11.62P <0 .0 0 5 ) ;无一例成胶质细胞瘤发现NCAM阳性表达 ,阳性表达率显著低于其它胶质瘤 (P =0 .0 0 0 )。结论 :PTEN基因突变在成胶质细胞瘤发生、发展中起重要作用 ;NCAM在成胶质细胞瘤侵袭。

过表达TAP1上调人胶质瘤细胞株U251 HLA-Ⅰ的表达

目的:探讨抗原提呈相关转运蛋白1(TAP1)过表达对人胶质瘤细胞株U251人类白细胞抗原Ⅰ(HLA-Ⅰ)表达的影响。方法:培养U251细胞,构建慢病毒载体并转染U251细胞,获得稳定高表达TAP1的细胞株并设立转染空载体对照组,分别收集U251细胞组、空载体对照组和TAP1基因转染细胞组细胞的蛋白和RNA,行real-time PCR和Western blotting分析过表达的TAP1对U251细胞HLA-Ⅰ表达的影响,并用流式细胞术分析U251细胞HLA-Ⅰ表面呈现的变化。结果:成功建立TAP1高表达U251细胞株,TAP1 mRNA和蛋白分别升高(8.73±1.07)倍和(11.71±0.83)倍。高表达的TAP1促进U251细胞HLA-A、HLA-B、HLA-C(重链)和β2微球蛋白(轻链)mRNA表达上调,分别升高(3.51±0.36)倍、(4.78±0.85)倍、(2.94±0.28)倍和(3.23±0.24)倍,HLA-Ⅰ蛋白表达升高(3.14±0.53)倍,同时U251细胞HLA-Ⅰ的表面呈现明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:过表达TAP1能促进U251细胞HLA-Ⅰ表达及其在细胞表面呈现的提高。

塞来昔布对胶质瘤U251细胞株生长的影响

目的:探讨COX-2抑制剂塞来昔布(celecoxib)对胶质瘤的抑制作用及可能的作用机制。方法:采用胶质瘤细胞株U251移植裸鼠后,服用塞来昔布,测量肿瘤重量;流式细胞仪检测药物对肿瘤细胞凋亡的影响;电镜观察药物作用前后肿瘤细胞超微结构的变化;免疫组织化学观察肿瘤微血管密度(MVD)。结果:药物治疗组和对照组肿瘤的重量分别为(51.3±3.85)mg和(125.2±7.34)mg;治疗组细胞凋亡增多;超微结构可见有凋亡特征的细胞。免疫组织化学可见MVD分别为(25.7±3.25)/HP和(76.4±9.41)/HP。结论:塞来昔布能够减少肿瘤血管生成,促进肿瘤细胞凋亡,从而对肿瘤具有抑制作用,对胶质瘤的治疗具有重要意义。

HHV-6A感染对神经胶质瘤细胞LncRNA MEG3表达及增殖凋亡侵袭转化的影响

目的:选取胶质瘤相关长链非编码RNA(LncRNA)MEG3,观察人类疱疹病毒6A亚型(HHV-6A)感染对神经胶质瘤细胞LncRNA MEG3表达及其增殖、凋亡、侵袭、转化的影响.方法:实时定量PCR检测人神经胶质瘤细胞和正常神经胶质细胞,以及37例胶质瘤组织、4例癌旁组织、18例正常脑组织中LncRNA MEG3的表达.细胞计数试剂盒检测HHV-6A感染后神经胶质瘤细胞吸光度D(450)值,流式细胞术检测细胞凋亡率,划痕实验观察细胞划痕愈合度,蛋白质印迹法检测细胞上皮间质转化(EMT)指标蛋白的表达水平.结果:在胶质瘤组织或细胞中,LncRNA MEG3的表达水平较正常对照组织或细胞低(P<0.05),而HHV-6A感染后的正常神经胶质细胞或胶质瘤细胞中LncRNA MEG3的表达也呈降低趋势(P<0.05).流式细胞术结果显示病毒感染后胶质瘤细胞的凋亡率为(6.05±0.40)%,对照组细胞凋亡率为(8.23±0.75)%,HHV-6A感染组凋亡率较对照组显著降低(P<0.05).划痕实验结果显示HHV-6A感染后细胞划痕愈合度[(72.33±6.90)%]大于对照组细胞划痕愈合度[(43.67±6.30)%],差异有统计学意义(P<0.05).Western blot结果显示,与对照组相比,病毒感染后细胞中Snail及Vimentin蛋白表达水平升高,E-cadherin蛋白的表达降低(P<0.05).结论:HHV-6A感染可下调神经胶质细胞及胶质瘤细胞中LncRNA MEG3的表达,促进胶质瘤细胞增殖侵袭和上皮间质转化,并抑制其凋亡.

PP2对C6神经胶质瘤细胞增殖和迁移的影响

目的探究PP2对C6神经胶质瘤细胞增殖和迁移的影响及其机制。方法根据处理情况将C6神经胶质瘤细胞分为空白对照组、50μg/L成纤维细胞生长因子2(FGF2)处理组(简称FGF2处理组)、50μg/L FGF2和0.02 mol/L PP2共处理组(简称共处理组)。采用Transwell小室和EdU实验检测PP2对C6神经胶质瘤细胞增殖和迁移的影响,采用蛋白质印迹方法检测酪氨酸蛋白激酶(Src)通路相关蛋白及核蛋白的表达。结果不同浓度PP2处理均可抑制C6神经胶质瘤细胞的存活(F=10.25~56.18,P<0.05、0.01)。与FGF2处理组相比,共处理组细胞增殖率明显降低(F=32.23,P<0.01),细胞迁移数量显著减少(F=22.15,P<0.01)。共处理组磷酸化成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)表达水平较FGF2处理组明显降低,差异有统计学意义(F=20.21,P<0.01)。在相同处理时间,FGF2处理组Src通路相关蛋白及核蛋白表达水平与共处理组比较差异均有显著性(F=10.17~278.11,P<0.05、0.01)。结论 PP2可通过靶向FGFR1和Src发挥抗肿瘤作用,这可能为研发神经胶质瘤的新型治疗药物提供一个新思路。

bFGF小分子干扰RNA诱导胶质瘤U251细胞凋亡作用的研究

目的:初步探讨以小分子干扰RNA沉默碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导胶质瘤细胞系U251凋亡的机制。方法:将U251细胞分为正常对照组、空载体组和实验组,按4×105个细胞每孔接种于6孔细胞培养板,培养24h后,空载体组和实验组按MOI=50分别进行空载体腺病毒(rAd5-null)和含有bFGF小分子干扰RNA(siRNA)的重组腺病毒(rAd5-bFGF)转染,转染72h后检测各组细胞的凋亡及细胞周期变化情况及其相关蛋白的表达。结果:与正常对照组、空载体组比较,实验组U251细胞经转染bFGF-siRNA后出现了明显的细胞凋亡(P<0.05),但细胞周期未见变化(P>0.05);Westernblot结果显示,实验组U251胶质瘤细胞经转染bFGF-siRNA72h后,bFGF蛋白表达明显降低,同时STAT3及Bcl-2蛋白表达降低,Bax及Caspase-3蛋白表达增强。结论:bFGF小分子干扰RNA能够诱导U251细胞凋亡,其作用可能是通过调节STAT3信号转导通路实现的。

免疫疗法可防止成神经细胞瘤复发

最新研究表明细胞联合体液的免疫疗法可提高人类散播型成神经细胞瘤小鼠模型的存活率。由此研究人员暗示该方法将最终用于人类防止初发的成神经细胞瘤治疗后的复发。

不同作用靶点的bFGF反义脱氧寡核苷酸对胶质瘤SWO-38细胞效应的观察

目的 :比较 3条针对不同位点的碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)反义脱氧寡核苷酸抑制神经胶质瘤SWO - 38细胞bFGF表达的效应。方法 :用脂质体介导bFGF反义脱氧寡核苷酸的转染入SWO - 38细胞 ,MTT及流式细胞术检测细胞增殖及凋亡的改变 ,Western -blot的方法检测bFGF蛋白水平的改变。结果 :3条脱氧寡核苷酸链的细胞增殖抑制率分别为 4 9% ,33% ,5 1% ,促进细胞凋亡率分别为 35 %、2 7%、18% ,对bFGF蛋白的表达降低分别为 6 3%、4 2 %、11%。结论 :对细胞增殖活力、凋亡率、bFGF蛋白水平均有明显效应的脱氧寡核苷酸序列才是理想的反义物质。

VEGF-C及其受体VEGFR-3在少突胶质细胞瘤中的表达

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF-C)及血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)在少突胶质细胞瘤中的表达。方法:检测45例少突胶质细胞瘤的VEGF-C和VEGFR-3的表达。结果:VEGF-C和VEGFR-3阳性表达率分别为51%和41%。两者表达一致的符合率为71%。VEGF-C和VEGFR-3与少突胶质细胞瘤病理分级呈显著正相关。结论:少突胶质细胞瘤中有VEGF-C和VEGFR-3表达。VEGF-C和VEGFR-3的表达与少突胶质细胞瘤的病理分级相关。