rhLEDGF p52基因原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化(英文)

目的 :构建 rhLEDGF p52 基因原核表达载体 , 获得rhLEDGF p52 蛋白。方法:利用基因重组技术将 rhLEDGF p52 基因构建于原核表达载体 pET30a(+)中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过 IPTG 诱导在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得表达,经免疫蛋白印迹试验对 rhLEDGF p52 进行鉴定并用 Ni-NTA His.Bind.Resin 方法进行纯化。结果:成功构建 rhLEDGF p52 基因原核表达载体,在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得可溶性形式表达,rhLEDGF p52蛋白表达量占菌体蛋白总量的 34.63%。Western Blot 结果显示 rhLEDGF2 蛋白能够特异性与 LEDGF-ab 结合。Ni-NTA His.Bind.Resin 方法进行纯化后的 rhLEDGF p52,终浓度达 520mg/L,分析其纯度达 87.93%。结论:获得 rhLEDGF p52 蛋白,这为深入研究其生物学功能奠定了基础。

siRNA-LEDGFp52真核表达载体的构建和鉴定

目的构建晶状体来源的上皮生长因子p52(lens epithelium derived growth factor p52,LEDGFp52)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)的真核细胞表达载体。方法以LEDGFp52为靶基因,以pGensil-1质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的LEDGFp52基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计2条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGensil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。结果经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体构建成功,重组质粒转染HeLa细胞48h,Western blotting检测到LEDGFp52蛋白表达的改变。结论利用RNAi技术可成功构建抑制LEDGFp52表达的小干扰RNA重组体。