人类白细胞抗原-G5慢病毒表达载体构建与病毒包装

目的:构建人类白细胞抗原G5(HLA-G5)的表达载体,并进行慢病毒包装,为进一步研究HLA-G5功能提供基础工具。方法:人工合成HLA-G5全长序列经测序正确后,定向接入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,转化入大肠杆菌,酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。结果:经琼脂糖凝胶电泳鉴定、PCR鉴定及测序,HLA-G5表达质粒质量合格,序列比对与设计序列符合率100%,HLA-G5慢病毒滴度测定为7.06×108。结论:成功地构建了HLA-G5表达载体并完成了慢病毒包装,为今后的研究工作提供了基础工具。

人类白细胞抗原-G5过表达慢病毒载体的构建以及JAR-HLA-G5稳转细胞株的建立

目的构建过表达人类白细胞抗原G5(HLA-G5)慢病毒载体,筛选建立稳定表达HLA-G5的JAR稳转细胞株。方法根据HLA-G5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片段。将目的基因定向接入经BamHI/AgeI酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒GV492-HLA-G5。筛选阳性克隆和测序鉴定后,使用三质粒包装系统将含有目的基因的重组质粒GV492-HLA-G5和辅助包装质粒共转染至293T细胞进行病毒包装及纯化并测定病毒滴度。设置过表达实验(OE)组和阴性对照(NC)组,在感染复数为20的条件下感染JAR细胞。用荧光显微镜观察各组绿色荧光蛋白的表达情况。用浓度为2μg·mL^(-1)嘌呤霉素筛选出稳定表达HLA-G5的JAR细胞株。用qRT-PCR和Western blot法检测JAR细胞中HLA-G5的mRNA和蛋白表达水平。结果经PCR及测序鉴定证明,序列与设计序列一致,成功构建重组慢病毒载体。病毒滴度结果显示,OE组的滴度为2×108TU·mL^(-1),NC组的滴度为4×108TU·mL^(-1)。qRT-PCR显示OE组JAR细胞中HLA-G5的mRNA(108.69±4.25)表达水平较NC组(1.00±0.76)明显增高(P<0.01)。Western blot显示OE组JAR细胞中HLA-G5的蛋白(65.84±14.11)表达水平较NC组(1.35±0.37)明显升高(P<0.01)。结论成功构建HLA-G5慢病毒载体并筛选建立JAR-HLA-G5稳转细胞株。

HLA-G5调节性T细胞在羊水过少孕妇中的表达差异

目的通过比较正常足月妊娠产妇和同期羊水过少产妇胎盘组织及外周血中人类白细胞抗原-G5(HLA-G5)的不同表达,旨在研究该免疫因子在母婴循环中的意义。方法通过流式细胞学技术,选择20例羊水过少产妇及15例同期正常产妇,检测HLA-G5因子在胎盘和外周血组织中的数值的表达,分析其在羊水过少发生中的意义。结果实验组(羊水过少产妇)与对照组(正常产妇)胎盘组织中CD4+HLA-G5+T淋巴细胞分别为0.68±0.32,1.91±1.14(P<0.05),而CD8+HLA-G5+T淋巴细胞所占比例分别为67.52±15.99,67.52±15.99(P<0.05).实验组与对照组外周血中分别对照分析结果均为(P>0.05)。结论 HLA-G5+在胎盘中的低表达可能与羊水过少的发生有关,对母胎液体交换有意义。