肠道病毒C组96型VP1蛋白线性B细胞表位筛选与鉴定

目的鉴定肠道病毒C组96型(enterovirus C96,EV-C96)VP1蛋白的线性B细胞表位。方法采用IEDB网站提供的在线分析工具分析、预测EV-C96 VP1蛋白的线性B细胞表位,结合其二级结构、β-转角、抗原性、亲水性等多项参数,筛选出优势候选表位;应用间接ELISA法检测候选表位与EV-C96免疫血清的反应性以及与21种其他常见手足口病病原血清的交叉反应性;应用微量中和试验测定表位抗体的中和效价;采用序列比对分析表位的序列保守性;应用结构对齐分析表位的结构特异性。结果通过生物信息学筛选出EVC96 VP1蛋白7个候选表位(P1~P7);ELISA法检测发现P7(氨基酸序列位置为282~304)与EV-C96多克隆抗体有强反应性,与其他常见EV多克隆抗体不发生明显反应;微量中和试验显示,P7抗体的中和效价低于1∶2;序列及结构分析结果显示,P7的氨基酸序列在EV-C96型内具有较高保守性,与其他EV相应位点氨基酸序列的结构有明显差异。结论P7表位为EV-C96特异的非中和性B细胞表位,可作为开发EV-C96检测试剂盒的候选抗原表位。

肠道病毒71型六安地区分离株VP1基因的生物信息学分析及B细胞表位预测

目的对肠道病毒71型(EV71)VP1基因编码衣壳蛋白进行系统结构与功能预测,为制备EV71疫苗和诊断抗原的研究提供理论基础。方法基于编号为1404-Luan(CHN)-08的EV71六安地区分离株VP1基因编码蛋白的氨基酸序列,应用ProtParam、SigalP、TMPRED、Sosui、SOPMA、Phyre、Bepipred等生物信息学方法预测其信号肽、跨膜区、疏水性、二级结构、三级结构等性质和潜在的B细胞表位。结果 EV71六安地区分离株VP1基因编码蛋白没有信号肽,无跨膜区,是一个亲水性蛋白;VP1蛋白二级结构以无规则卷曲和β-片层为主,含有少量的α-螺旋,少见β-转角;VP1的三级结构中4～121氨基酸部分在蛋白表面形成一环状结构(VPl GH loop);EV71 VP1潜在的B细胞表位共有6个可能的抗原表位。其中,预测分值最高的线性表位区域位于157～177位氨基酸残基。结论成功预测了EV71六安地区分离株VP1二级结构、三级结构和B细胞表位,为制备EV71基因工程疫苗和诊断抗原的开发提供了理论基础。

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型分离株的VP1基因特征分析

目的:探讨苏皖地区手足口病(HFMD)患者肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)分离株的VP1基因特征。方法:采集南京市、马鞍山市2009至2010年HFMD患者临床标本进行病毒分离和RT-PCR鉴定;扩增并测定VP1基因序列;从GenBank中选取EV71和CA16不同基因型参考毒株,利用生物信息学软件进行同源性比对和系统进化树分析。结果:共分离到9株EV71和4株CA16,EV71分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.5%～99.8%和99%～100%;CA16分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性为96.2%～98.5%和99.3%～100%;系统进化树分析显示,9株EV71全部属于C4a基因亚型,而4株CA16则全部属于B1b基因亚型。结论:2009至2010年苏皖地区分离到的EV71和CA16毒株分别属于C4a和B1b基因亚型,与国内其他地区HFMD病原学及分子进化研究结果一致,有望成为疫苗候选株作进一步研究。

湖北肠道病毒EV71型流行株VP1基因以及蛋白结构特征分析

目的全面研究和了解2011年湖北省肠道病毒71型的VP1基因及蛋白结构特征，分析EV71型病毒在湖北省的基因型别，探讨该型病毒在全省的地理分布特征。方法对2011年湖北省8个区市的20株EV71流行株进行VP1区全长基因序列测定，并对核苷酸序列进行同源性比较及系统进化分析，并对VP1蛋白序列的亲水性、柔韧性等二级和三级结构进行分析。结果2011年湖北省EV71型流行株的基因亚型为C4a亚型，其VP1区核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性较高，分别为96．5％～98．7％和98．3％～100％。VP1蛋白特征分析发现该区主要免疫表位均没有发生变异且存在较多亲水性区域。二级结构以无规则卷曲为主，其次为8片层。蛋白质同源建模未发现不同毒株间VP1蛋白三级结构差别。结论2011年湖北省Ev71型流行株与我国其它地区的毒株有较高同源性，且存在一定的地理区域聚集性特征和遗传多样性特点。同时综合多种方法预测EV71VP1的二级结构和三级结构，为进一步研究开发相关药品和防治EV71感染提供理论基础。

肠道病毒71型结构蛋白VP1的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌表达系统表达EV71 VP1蛋白并对其抗原性进行初步鉴定;为EV71疫苗研制奠定基础。方法采用PCR扩增EV71 VP1基因2-274aa片段,并将其插入表达载体pET30a(+),转化Transetta(DE3)菌株,SDS-PAGE和Western Blot初步分析蛋白表达及抗原性;探讨目的蛋白的最佳表达条件。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,Western Blot证实其抗原性良好;该蛋白的最佳表达条件是37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导表达4 h。结论表达并鉴定了EV71 VP1抗原;本研究为EV71疫苗研制及检测试剂盒的建立奠定了基础。

2007—2008年肠道病毒71型北京地区分离株的VP4基因序列分析

为了解2007-2008年北京地区流行的肠道病毒71型(EV71)是否存在基因序列变异及其与病毒毒力的关系,我们选择2007年分离的3株EV71(其中1株分离自重症手足口病患儿的咽拭子标本,其余2株分离自普通手足口病患儿咽拭子标本)和2008年分离的5株EV71(其中3株分离自重症手足口病患儿的咽拭子或鼻拭子标本,2株分离自普通手足口病患儿的疱疹液标本),提取基因组RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到VP4基因片段,并进行核苷酸序列测定,使用生物信息软件与GenBank中的EV71 VP4基因进行序列及病毒型别分析。结果表明,所测得的8株EV71 VP4基因全长均为207bp,编码69个氨基酸,理论相对分子质量(Mr)为7×103。8株EV71病毒VP4基因的核苷酸同源性在94%～100%,与GenBank中其他EV71病毒株VP4的核苷酸同源性为82%～100%,与阜阳、深圳和台湾等地区流行的EV71 VP4的核苷酸同源性比其他地区高。除了与印度报道的VP4编码的氨基酸在第7和54位不同外(印度株:7位蛋氨酸,54位苏氨酸;其余株7位苏氨酸,54位丙氨酸),这8株EV71VP4编码的氨基酸序列之间以及与其他EV71 VP4编码的氨基酸同源性均为100%。8株EV71病毒VP4与文献报道的3株重症感染病毒株VP4(BrCr、MS和NCKU9822)核苷酸有较大差别,而8株病毒株中从重症感染(BJ97、BJ110B、BJ110Y和BJ4243)与轻症感染(BJ25、BJ47、BJ65和BJ67)分离到的毒株之间VP4基因序列未见明显改变,只有几个核苷酸存在差别。VP4核苷酸序列的进化树分析表明,这8株EV71均属于C4亚型,显示2007-2008年北京地区流行的EV71的VP4基因相当保守,分离自伴有神经系统感染的重症手足口病和普通手足口病患儿的EV71的VP4基因之间在核苷酸水平未出现同样的变异。结果提示,近2年来北京地区所流行的EV71属C4亚型。

肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因部分序列在大肠杆菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定肠道病毒71型广州株EVGZ06VP1基因部分序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆肠道病毒71型广州株EVGZ06全长VP1蛋白基因并测序的基础上,将部分VP1蛋白基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建了重组表达质粒pET28a(+)/(502～891)VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量为19 000,与预计大小一致。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了肠道病毒71型VP1基因部分序列,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。

肠道病毒71型外壳蛋白VP1在大肠杆菌中的表达

将扩增得到的肠道病毒71型外壳蛋白VP1基因克隆到测序载体pGEM-T,测序验证该序列为目的片段后,将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-5x-1中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE分析和Western blot验证。结果表明,在经IPTG诱导的BL21中检测到分子量与预期大小相符的大约60 kDa的融合蛋白。利用表达产物作为抗原,对EV71感染病人阳性血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的检测用抗原。

临床手足口病肠道病毒71型VP1基因分析

目的对临床手足口病(HFMD)的病原体肠道病毒71型(EV71)分离株VP1基因测序分析,从分子水平探究HFMD的分子遗传进化变迁情况。方法收集2015年1月至2016年12月期间在延安医院临床就诊疑似HFMD患者590例,采集粪便标本,用实时荧光PCR法进行EV71病毒核酸检测,对EV71检测阳性粪便样本进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增VP1目的基因,扩增阳性产物进行测序和序列比对,分析同源性并确定其所属基因亚型,并构建种系遗传进化发育树。结果共检出EV71型50例,检出率为8.47%(50/590例),2015年检出28例,2016年检出22例。50例中≤5岁35例,5-18岁13例,≥18岁2例;男性占64.00%(32/50例),女性36.00%(18/50例),女性患者中包括2例成人HFMD患者。检出的50株EV71毒株均为EV71C4亚型。检出的EV71毒株与国内北京和安徽以及马来西亚地区的毒株遗传距离为0.026,与浙江、广东地区毒株的遗传距离为1.52,与澳大利亚地区毒株的遗传距离为2.11。结论亲缘关系进化树显示,EV71毒株2年间未发生大的基因遗传变异。EV71毒株与北京、安徽以及马来西亚EV71流行毒株遗传距离较近,与浙江、广东等地的EV71流行毒株遗传距离较远,与澳大利亚分离的EV71毒株遗传距离最远。

肠道病毒71型外壳蛋白VP2在Pichia．pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法,克隆肠道病毒71型(Entero-virus 71,EV71)SHZH03株外壳蛋白VP2基因,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP2,经序列测定证实-αfactor信号肽和VP2的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导筛选到高效表达VP2蛋白的工程菌株。用饱和硫酸铵法对重组蛋白VP2进行了较好的纯化。Western Blot分析表明,重组蛋白VP2具有较好的反应原性,从而为发展EV71快速、高效、廉价诊断试剂奠定了基础。

肠道病毒71型VP1蛋白二级结构及B细胞表位的预测

目的预测C4基因亚型肠道病毒71型的VP1蛋白二级结构及B细胞表位,为EV71疫苗研制提供理论基础。方法本研究将宁波地区EV71分离株与国内外EV71代表株进行同源性分析和并构建亲缘进化树。以VP1基因序列为材料,应用EX-PASY服务器上的GOR4、SOPMA两种方法分析预测蛋白质二级结构,并结合蛋白质的亲水性、柔韧性、表面可能性等指标综合评价VP1蛋白的B细胞抗原表位。结果同源性分析和亲缘进化分析得出,2010年宁波EV71分离株属于C4a基因亚型,与基因库检索到的C4a基因亚型代表株核苷酸和氨基酸同源性较高,分别为93.6%～99.3%和98.3%～100%。VP1蛋白二级结构以无规则卷曲和β-片层为主,有多处抗原指数较高的区段,结合亲水性、柔韧性、表面可能性等指标,综合预测VP1蛋白的B细胞抗原表位在第39～40、159～167、212～220、287～290位氨基酸残基的可能性较大。结论 EV71VP1蛋白多个区段具有抗原潜力通过生物信息学方法预测VP1蛋白二级结构及B细胞表位为EV71疫苗研制提供理论基础。

肠道病毒71型VP1基因的表达纯化及初步应用

目的表达纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA检测方法。方法通过化学法合成肠道病毒71型VP1全基因序列,构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21(DE)3,IPTG诱导表达,镍金属亲和层析纯化目的蛋白,产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定。以目的蛋白作为包被抗原,初步建立间接ELISA检测方法,并对77份6～10岁无手足口病症状儿童血清及手足口病现症患儿血清进行检测。结果成功构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,VP1融合蛋白分子量约为43 kD,纯度可达95%;初步建立了人血清中抗EV71 IgG间接ELISA检测方法,36例HFMD现症患儿中EV71 IgG阳性22例(61.11%);41例无手足口症状儿童血清中EV71 IgG阳性21例(51.22%)。结论表达产物具有较好的免疫原性,可用于肠道病毒71抗体检测。

肠道病毒71型外壳蛋白VP1全长在大肠杆菌中的高效表达及初步活性测定

目的:重组表达肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1全长,用于研制血清学检测试剂和疫苗研发。方法:在获得EV71全长基因并测序正确的基础上,将外壳蛋白VP1全长基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用双抗原夹心检测技术评价重组抗原与27份EV71抗体阳性血清和18份阴性血清的反应情况。结果:重组EV71-VP1蛋白在大肠杆菌中诱导6 h后可获得高效表达,能与27份EV71抗体阳性血清中的21份发生阳性反应,EV71双抗原夹心检测与中和血清测试结果具有很好的一致性(P<0.05)。结论:实现了肠道病毒71型外壳蛋白VP1的高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定了基础。

肠道病毒71型SHZH03株VP1基因的进化分析

构建了肠道病毒71型(EV71)中国(深圳)分离株SHZH03全基因组的8个相互重叠的克隆,对其全基因组7406bp的核苷酸进行序列测定,利用DNA-Star软件分析外壳蛋白基因VP1的遗传进化。结果表明,SHZH03和SHZH98与亚洲流行株中的台湾1998年流行株、日本1999年流行株的遗传距离较近,而与新加坡2000年和2001年流行株的遗传距离较远;SHZH03株与一些欧洲流行株有较大的差异。以上结果说明我国深圳地区流行的肠道病毒71型有可能来源于台湾1998年的EV71大规模流行时的毒株。

肠道病毒71型SHZH03株VP2和VP4基因的进化分析

目的:对SHZH03株、SHZH98株、亚洲流行株(中国台湾98年、日本99年及新加坡2000和2001年流行株等)以及一部分欧洲流行株等的VP2和VP4基因进行了遗传进化分析.方法:在对肠道病毒71型中国(深圳)分离株SHZH03进行全基因组序列测定的基础上,利用DNA-STAR软件对VP2和VP4基因进行遗传进化分析.结果:SHZH03和SHZH98与亚洲流行株中的中国台湾98流行株、日本99流行株的遗传距离较近,而与新加坡2000和2001年流行株的遗传距离较远;SHZH03株与一些欧洲流行株有较大的差异.结论:中国深圳地区流行的肠道病毒71型有可能来源于中国台湾1998年EV71大规模流行时的毒株.

西安市手足口病肠道病毒71型分离株VP1区基因特征分析

目的：了解西安市2012年手足口病肠道病毒71型分离株VP1区基因特征，探讨基因型与病情轻重间的关系。方法采集肠道病毒71型（EV71）患者咽拭子或粪便标本，按等概率法随机选择6例普通型和6例重型EV71分离株，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）对EV71分离株进行VP1区基因扩增及核酸测序，并将测序结果与EV7各基因型代表株进行同源性和遗传进化分析。结果12株EV71分离株的基因型为C4基因亚型，其与C4亚型代表株VP1区核苷酸和氨基酸同源性最高，分别91.8%~93.0%和98.3%~99.3%，6例普通型和6例重型EV71分离株在VP1基因型区无明显差异，对12株EV71分离株进行遗传进化分析显示，12株流行株与C4亚型代表株聚集于同一个分支。结论西安12株EV71流行株的基因型属于C4亚型，基因型与病情严重程度可能无关。

宁夏2011年肠道病毒71型VP1区域序列分析

目的 分析2011年宁夏肠道病毒71型分离株VP1的遗传特征.方法 对宁夏40株EV71分离株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸序列进行同源性比较及遗传进化分析.结果 2011年宁夏40株分离株与A、B、C型基因型代表株的核苷酸同源性分别为80.9%～82.7%、81.4%～84.8%、87.2%～93.7%,氨基酸同源性分别为94%～95%、96.6%～98%、97.7%～99.7%,与C4a亚型同源性最高;VP1区遗传进化分析表明,这40株同属于C4a亚型.结论 2011年宁夏流行的肠道病毒71型均为C4a亚型,病毒未产生明显的变异,其流行存在多条传播链.

肠道病毒71型外壳蛋白VP3在Pichia.pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法克隆肠道病毒71型SHZH98株外壳蛋白VP3基因,连接T载体,经序列测定后,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP3,经序列测定证实-factor信号肽和VP3的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导,筛选到5株高效表达VP3蛋白的工程菌株.ELISA实验表明:重组蛋白VP3具有较好的免疫原性.

肠道病毒71型SHZH03株VP1基因在毕赤酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增得到肠道病毒71型(EV71SHZH03)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒VP1/pPIC9K,转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115,以Myc-Tag多克隆抗体作为一抗,利用双层滤膜法筛选酵母转化子.甲醇诱导表达.SDS-PAGE分析显示:表达产物的分子量约为30000,与天然VP1大小一致;ELISA实验表明,表达上清液可与EV71患者急性感染期血清呈阳性反应,表明重组蛋白VP1具有免疫原性.