目的:利用噬菌体随机肽库筛选与人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞存在特异性结合的多肽,为实现对肺泡Ⅱ型上皮细胞的靶向干预和开发针对急性肺损伤等呼吸系统疾病治疗的导向药物载体提供实验依据。方法:采用全细胞筛选的方式,通过对人肺泡Ⅱ型上...目的:利用噬菌体随机肽库筛选与人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞存在特异性结合的多肽,为实现对肺泡Ⅱ型上皮细胞的靶向干预和开发针对急性肺损伤等呼吸系统疾病治疗的导向药物载体提供实验依据。方法:采用全细胞筛选的方式,通过对人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞的4轮筛选和与人前列腺癌上皮PC-3细胞的差减筛选,从噬菌体随机肽库中筛选出与人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞存在特异性结合的多肽,选择丰度较高的一条命名为NTG,用其构建含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)的原核表达载体,转化感受态细菌,层析法获得重组蛋白His-NTG-EGFP,测定其分子质量。向A549细胞和PC-3细胞分别加入含有重组蛋白His-NTG-EGFP或His-EGFP的培养基,荧光显微镜下观察。结果:从第1轮至第4轮,淘选所得的噬菌体回收率逐步提高,经过PC-3细胞差减筛选,少量的与A549细胞存在特异性结合的噬菌体得到了回收。重组表达并纯化得到的His-NTG-EGFP,测定其分子质量为33 k D,与预期相符。荧光显微镜下观察发现,经融合蛋白His-NTG-EGFP处理后的A549细胞表面有绿色荧光分布,经融合蛋白His-NTG-EGFP处理后的PC-3细胞以及经对照蛋白处理的A549细胞和PC-3细胞表面均未出现绿色荧光,说明这一融合蛋白可以特异性结合A549细胞。结论:人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞特异性靶向肽被成功获得。展开更多
文摘目的探讨不同时间高浓度氧对肺泡Ⅱ型细胞(AECII)内质网自噬与肺泡表面活性物质产生功能之间的关系。方法将大鼠RLE-6TN细胞分为对照组(C组,21%O2常规培养72 h)、高氧H1、H2、H3、H4组(95%O2分别培养12、24、48、72 h)。实时荧光定量PCR法检测内质网自噬受体ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA水平,Western blot法检测内质网自噬相关蛋白ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的水平,ELISA法检测各组二棕榈酰卵磷脂(DPPC)水平。结果与C组相比,H1组ATL3、SEC62的mRNA水平、CCPG1的蛋白水平、DPPC产量下降(P<0.05),CCPG1、FAM134B、RTN3的mRNA水平、ATL3、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平显著下降(P均<0.01);H2组ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA水平、ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平差异无统计学意义(P均>0.05),DPPC产量增高(P<0.05);H3、H4组ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的mRNA水平、ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3、SEC62的蛋白水平、DPPC产量显著下降(P均<0.01)。与H1组相比,H2组CCPG1、FAM134B的mRNA水平、ATL3、RTN3的蛋白水平、DPPC产量显著增高(P<0.01),SEC62的蛋白水平增高(P<0.05);H3组ATL3、SEC62的蛋白水平显著下降(P<0.01),RTN3的mRNA水平、RTN3的蛋白水平下降(P<0.05);H4组ATL3的mRNA水平、CCPG1的蛋白水平下降(P<0.05)、RTN3的mRNA水平、ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平显著下降(P<0.01)。与H2组相比,H3组、H4组ATL3、CCPG1、FAM134B、RTN3的mRNA水平、ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平、DPPC产量显著下降(P均<0.01);H4组SEC62的mRNA水平下降(P<0.05);H3组CCPG1、FAM134B的蛋白水平下降(P<0.05);H4组CCPG1、FAM134B的蛋白水平显著下降(P<0.01);与H3组相比,H4组ATL3、RTN3、SEC62的蛋白水平显著下降(P<0.01);其余各组差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论高氧12 h AECII内质网自噬水平、DPPC产量下降;高氧24 h AECII内质网自噬水平恢复到基础值,DPPC产量达到峰值,48 h后内质网自噬水平、DPPC产量再次下降,72 h后AECII内质网自噬水平、DPPC产量衰减仍保持较低水平,AECII内质网自噬与其功能密切相关。
文摘目的:利用噬菌体随机肽库筛选与人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞存在特异性结合的多肽,为实现对肺泡Ⅱ型上皮细胞的靶向干预和开发针对急性肺损伤等呼吸系统疾病治疗的导向药物载体提供实验依据。方法:采用全细胞筛选的方式,通过对人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞的4轮筛选和与人前列腺癌上皮PC-3细胞的差减筛选,从噬菌体随机肽库中筛选出与人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞存在特异性结合的多肽,选择丰度较高的一条命名为NTG,用其构建含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)的原核表达载体,转化感受态细菌,层析法获得重组蛋白His-NTG-EGFP,测定其分子质量。向A549细胞和PC-3细胞分别加入含有重组蛋白His-NTG-EGFP或His-EGFP的培养基,荧光显微镜下观察。结果:从第1轮至第4轮,淘选所得的噬菌体回收率逐步提高,经过PC-3细胞差减筛选,少量的与A549细胞存在特异性结合的噬菌体得到了回收。重组表达并纯化得到的His-NTG-EGFP,测定其分子质量为33 k D,与预期相符。荧光显微镜下观察发现,经融合蛋白His-NTG-EGFP处理后的A549细胞表面有绿色荧光分布,经融合蛋白His-NTG-EGFP处理后的PC-3细胞以及经对照蛋白处理的A549细胞和PC-3细胞表面均未出现绿色荧光,说明这一融合蛋白可以特异性结合A549细胞。结论:人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞特异性靶向肽被成功获得。