人类脐血间充质干细胞在急性肝坏死大鼠体内分化潜能的实验研究

目的探索人类脐血间充质干细胞在急性肝坏死大鼠体内肝样细胞自主分化的潜能。方法体外分离培养人类脐血间充质干细胞。CC l4橄榄油溶液腹腔注射SD大鼠建立急性肝坏死大鼠模型。造模24 h后肝脏局部注射移植人类脐血间充质干细胞给急性肝坏死大鼠模型,造模后1周、2周和4周分别处死6只模型鼠,取肝脏切片做免疫组织化学检测人类特异性ALB、AFP、HepPar的表达,实时荧光RT-PCR检测人类特异性ALB、AFP、CK19、CK18的表达,测序扩增产物。结果体外分离培养的脐血来源细胞符合人类脐血间充质干细胞的生物学特性。处死移植模型鼠,肝脏免疫组织化学检测显示:人类特异性ALB、AFP、HepPar在接受移植的模型鼠体内呈阳性表达;实时荧光RT-PCR检测显示:人类特异性ALB、AFP、CK19、CK18在接受移植的模型鼠体内呈阳性表达,扩增产物序列与GENEBANK对应序列一致。结论无外部诱导干预,人类脐血间充质干细胞在急性肝坏死大鼠体内已具有肝样细胞自主分化潜能。

人脐带间充质干细胞来源外泌体降低脊髓损伤后血脊髓屏障的通透性

背景:研究发现,内皮素参与了脊髓损伤后血脊髓屏障的破坏,干细胞来源外泌体可降低血脊髓屏障的通透性,修复脊髓损伤。目的:观察人脐带间充质干细胞来源外泌体是否可以通过抑制内皮素1表达降低血脊髓屏障的通透性,进而修复脊髓损伤。方法:用超速离心法从人脐带间充质干细胞培养上清液中提取外泌体,透射电子显微镜观察其形态,Western blot检测tsg101、CD63的表达。80只SD大鼠随机分成假手术组、模型组、外泌体组、内皮素1组(n=20),采用改良Allen’s法制备大鼠脊髓损伤模型,内皮素1组用微量注射器直接向损伤部位注射10μL(1μg/mL)内皮素1,术后即刻及1,2 d,分别给予假手术组、模型组尾静脉注射200μL PBS,外泌体组、内皮素1组尾静脉注射200μL外泌体(200μg/mL)。脊髓损伤后第1,3,7,14,21天进行后肢运功功能评分;损伤后第7天通过伊文思蓝染色观察血脊髓屏障通透性,Western blot检测脊髓组织中紧密连接蛋白ZO-1、β-Catenin、Occludin和内皮素1的表达。结果与结论:①外泌体组BBB评分在损伤后3-21 d显著高于模型组(P<0.05),苏木精-伊红染色显示外泌体组脊髓损伤较模型组明显减轻;内皮素1组BBB评分较外泌体组显著降低(P<0.05),内皮素1组脊髓损伤较外泌体组加重;②模型组内皮素1表达量较假手术组显著增加(P<0.05),外泌体组内皮素1表达量较模型组显著降低(P<0.05);③与模型组比较,外泌体组血脊髓屏障伊文思蓝渗出量显著减少(P<0.05),紧密连接蛋白β-Catenin、Occludin、ZO-1的表达增加(P<0.05);与外泌体组比较,内皮素1组伊文思蓝渗出量显著增加(P<0.05),上述紧密连接蛋白表达量显著减少(P<0.05);④结果表明,人脐带间充质细胞来源外泌体通过下调内皮素1表达来保护血脊髓屏障的通透性,起到了修复脊髓损伤的作用。

脐血间充质干细胞来源外泌体治疗糖尿病足的研究进展

糖尿病足溃疡(DFU)是糖尿病最严重的慢性并发症之一,主要由外周血管闭塞引起,并伴有不同程度的感染。糖尿病足溃疡的治疗在临床医学中极具挑战性,它带来了坏疽、截肢甚至死亡风险。人脐血间充质干细胞来源的外泌体(HUMSCs-Exos)具有组织修复和再生的潜力,在支持或加速伤口愈合过程中的潜在用途已引起越来越多的关注。现对人脐血间充质干细胞来源的外泌体的生物学特性和功能、在糖尿病足溃疡创面愈合中的作用机制及给药方式进行综述,旨在为糖尿病足溃疡的治疗提供新思路。

脐带血间充质干细胞对角膜新生血管形成的抑制作用

目的:研究球结膜下注射人脐带血来源的间充质干细胞悬液治疗角膜碱烧伤新生血管的有效性。方法:本研究将30只新西兰家兔制备右眼碱烧伤模型,随机分实验组和对照组各15只(15眼)。实验组球结膜下注射脐带血来源间充质干细胞悬液,对照组不给予球结膜下治疗。采用裂隙灯生物显微镜观察并拍照记录注射后第5天,14天角膜新生血管情况,计算角膜新生血管面积。取两组角膜进行HE染色,观察角膜上皮愈合情况。结果:实验结果显示,第5天实验组和对照组之间的角膜新生血管面积差异没有显著性统计意义(P > 0.05),但第14天实验组的新生血管面积显著小于对照组(P < 0.05)。结论:本研究结果证明,球结膜下注射人脐带血间充质干细胞可抑制角膜新生血管并促进碱烧伤角膜上皮的修复。

补肾活血解毒方联合脐带间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠的治疗作用

目的:观察补肾活血解毒方联合大鼠脐带间充质干细胞(rUCMSCs)移植对急性肝衰竭(ALF)大鼠的治疗作用。方法:采用两步消化法提取rUCMSCs。使用D-氨基半乳糖/脂多糖(D-gal/LPS)构建ALF大鼠模型,24 h后将存活的40只模型大鼠随机分成中药联合移植组、移植对照组、中药对照组及空白对照组。中药联合移植组和移植对照组予以2×10^(6)个rUCMSCs尾静脉注射,余下两组予以等体积无菌PBS溶液尾静脉注射;中药联合移植组和中药对照组予以补肾活血解毒方灌胃(每次10 mL/kg),其余两组予以等量生理盐水灌胃,每日观察各组大鼠一般情况。治疗后第7天,计算各组大鼠7天生存率,并检测其血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBIL)水平,然后通过苏木-伊红(HE)染色观察其肝、肺组织病理学改变。结果:造模后,模型大鼠生存状态逐渐下降,肝功能明显异常。经治疗后,中药联合移植组、移植对照组、中药对照组、空白对照组生存率分别为70%、50%、40%、20%,中药联合移植组生存率显著高于空白对照组(P﹤0.05);中药联合移植组大鼠血清TBIL、ALT、AST水平显著下降,与移植对照组、中药对照组、空白对照组相比,差异有统计学意义(P﹤0.05);病理检测显示中药联合移植组大鼠肝脏组织明显修复,肝小叶结构完整,炎性细胞浸润明显减少,且未见肺栓塞、肺纤维化等不良反应。结论:补肾活血解毒方联合rUCMCSs移植治疗可明显缓解ALF大鼠肝脏炎症反应,改善肝功能,促进肝再生,提高ALF大鼠的存活率,且治疗效果优于二者单独应用,补肾活血解毒方与rUCMCSs联合应用对ALF的治疗具有协同作用。

补肾活血方促进脂肪间充质干细胞类髓核分化的作用机制

背景:干细胞移植是防治椎间盘退变的新思路,但移植后的干细胞如何顺利存活、增殖、分化,并恢复髓核细胞功能,是目前亟需克服的重点和难点。目的:探讨补肾活血方对脂肪间充质干细胞存活、增殖、类髓核分化的影响。方法:采用Transwell小室构建人脂肪间充质干细胞和人退变髓核细胞共培养模型。实验分为对照组、模型组、含药血清组、无药血清组,除对照组外,其余各组均用50μmol/L叔丁基过氧化氢干预24 h,然后含药血清组和无药血清组分别予以含体积分数20%补肾活血方含药血清或无药血清的DMEM低糖完全培养液干预48 h,取下层脂肪间充质干细胞,甲苯胺蓝染色法观察蛋白聚糖合成水平,Real-Time PCR法检测Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9的mRNA表达,Western blot法检测SOX9的蛋白表达,乳酸脱氢酶法检测细胞毒性,流式细胞术检测细胞活性氧水平,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。结果与结论:①与对照组相比,模型组坏死脱落细胞比例增加,甲苯胺蓝染色变浅,Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA和SOX9蛋白表达水平下降(P<0.05);与模型组相比,补肾活血方含药血清可显著减轻细胞损伤并促进Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA和SOX9蛋白表达(P<0.05),但无药血清组改善不明显(P>0.05);②与对照组相比,模型组细胞毒性、活性氧水平、细胞衰老水平显著增加;与模型组相比,补肾活血方干预后共培养体系微环境得到明显改善(P<0.05),无药血清对共培养体系微环境改善作用不明显(P>0.05);③结果表明,补肾活血方可以促进脂肪间充质干细胞存活、增殖、类髓核分化。

补肾活血方促进骨髓间充质干细胞的成骨及其防治大鼠骨质疏松症机制研究

目的 研究表明微核糖核酸(microRNA,MiRNA)和Kruppel样因子10(Kruppel-like factor10, KLF10)调控骨质疏松症的进程。研究旨在探讨miR-26b/KLF10信号调控骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)分化的机制。方法 流失鉴定分离的大鼠BMSCs,不同剂量的补肾活血方处理BMSCs,检测其^([1-2])增殖能力,碱性磷酸酶活性和茜素红染色检测BMSCs的成骨分化潜能。qPCR检测不同剂量的补肾活血方处理BMSCs后,miR-26b和KLF10的表达水平。mirtarBase数据库检测KLF10 mRNA的3’非翻译区(untranslated regions, 3'UTR)上是否有miR-26b的结合位点,双荧光素酶报告实验检测miR-26b对KLF10启动子活性的影响。qPCR检测miR-26b/KLF10信号对BMSCs增殖和成骨分化标志物的表达的影响。Western blot检查Wnt/β-catenin信号是否被激活。结果 流式分析显示分离的原代细胞大部分是BMSCs。补肾活血方显著促进骨髓间充质干细胞的增殖,补肾活血方显著提高了BMSCs中碱性磷酸酶的水平和成骨分化的潜能。补肾活血方促进BMSCs中miR-26b和KLF10的表达。在KLF10 mRNA的3’UTR上有miR-26b的结合位点。在BMSCs中,miR-26b抑制KLF10的3’UTR荧光素酶活性。此外,miR-26b也抑制了KLF10的表达水平。CCK8(Cell Counting Kit-8)显示KLF10促进BMSCs增殖,qPCR显示miR-26b显著抑制成骨分化标志物的表达。而KLF10能够逆转miR-26b的抑制效应,提示miR-26b/KLF10信号介导了补肾活血方在BMSCs增殖和成骨分化中的效应,且补肾活血方通过激活Wnt/β-Catenin信号通路促进成骨。结论 补肾活血方促进BMSCs的成骨由miR-26b/KLF10/Wnt/β-Catenin信号轴调控。

复方补肾活血颗粒含药血清经β-catenin/TRIB3调控人骨髓间充质干细胞成骨成脂分化

目的探讨复方补肾活血颗粒(Compound Kidney-invigorating Granule,CKG)含药血清基于β-catenin/tribbles假激酶3(tribbles pseudokinas 3,TRIB3)调控人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨成脂分化的作用机制。方法纯化原代BMSCs;BMSCs转染β-catenin-siRNA,成骨诱导后,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、茜素红染色观察BMSCs成骨分化情况,qPCR法、Western blot法分别检测β-catenin、TRIB3、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、ALP mRNA及蛋白表达水平;Western blot法检测CKG对BMSCs中β-catenin及TRIB3蛋白表达水平的影响;BMSCs转染β-catenin-siRNA,CKG含药血清培养后,ALP染色、茜素红染色及油红O染色观察BMSCs成骨成脂分化情况,qPCR法、Western blot法分别检测β-catenin、TRIB3、OPN、RUNX2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、adiponectin mRNA及蛋白表达水平。结果BMSCs转染β-catenin-siRNA后,ALP活力金氏单位值显著降低(P<0.05),矿化结节生成减少,TRIB3、OPN、RUNX2、ALP mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05);CKG能促进BMSCs中β-catenin、TRIB3蛋白的表达(P<0.05)。BMSCs转染β-catenin-siRNA并用CKG含药血清干预后,5%含药血清+siRNA组细胞中钙钴染色结块与红色钙化结节数量多于0%含药血清组,低于5%含药血清组;5%含药血清+siRNA组细胞中脂肪粒数量多于5%含药血清组,低于0%含药血清组;5%含药血清+siRNA组TRIB3、OPN、RUNX2 mRNA和蛋白表达水平,ALP活力金氏单位值显著高于0%含药血清组(P<0.05),低于5%含药血清组和5%含药血清+阴性对照组(P<0.05);5%含药血清+siRNA组中PPARγ、adiponectin mRNA和蛋白表达水平低于0%含药血清组(P<0.05),高于5%含药血清组和5%含药血清+阴性对照组(P<0.05)。结论内源性敲低β-catenin抑制BMSCs的成骨分化能力,降低TRIB3的表达;CKG含药血清促进BMSCs中β-catenin与TRIB3的表达;CKG含药血清可以调控BMSCs成骨成脂分化,其作用机制可能与β-catenin/TRIB3通路相关。

电针联合人脐带间充质干细胞移植对缺血性脑损伤大鼠血脑屏障及腺苷A2A受体、GSK-3β/β-catenin表达的影响

【目的】观察电针百会、风府、双侧肾俞穴联合人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)移植对缺血性脑损伤大鼠的脑保护作用及机制。【方法】将40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、移植组、联合组,每组10只。除正常组,其他各组大鼠建立脑缺血再灌注损伤模型。在造模结束24 h后,移植组大鼠给予0.5 m L 2×10^(6)个hUC-MSCs细胞悬液一次性尾静脉植入,联合组在移植组治疗基础上,给予电针百会穴、风府穴、双侧肾俞穴,每次30 min,每日1次,连续针刺3周。治疗结束后,苏木素-伊红(HE)染色法观察海马组织病理形态,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法观察脑组织细胞凋亡情况,免疫荧光法检测脑组织腺苷A2A受体(ADORA2A)表达,免疫组织化学法检测脑组织糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、β-连环蛋白(β-catenin)表达,Western Blot法检测脑组织跨膜蛋白闭锁蛋白(Occludin)、胞质附着蛋白(ZO-1)表达。【结果】与正常组比较,模型组脑组织细胞凋亡率升高,脑组织ADORA2A阳性表达率及GSK-3β蛋白表达水平升高,Occludin、ZO-1、β-catenin蛋白表达水平降低(P<0.05),HE染色结果显示,模型组海马组织结构明显异常;与模型组比较,移植组和联合组大鼠脑组织细胞凋亡率降低,脑组织ADORA2A阳性表达率及GSK-3β蛋白表达水平降低,Occludin、ZO-1、β-catenin蛋白表达水平升高(P<0.05),海马组织病理程度明显减轻;与移植组比较,联合组脑组织细胞凋亡率降低,脑组织ADORA2A阳性表达率及GSK-3β蛋白表达水平降低,Occludin、ZO-1、β-catenin蛋白表达水平升高(P<0.05)。【结论】电针百会、风府、双侧肾俞穴联合hUC-MSCs可改善缺血性脑损伤大鼠血脑屏障,抑制脑组织ADORA2A、GSK-3β表达,提高β-catenin表达,抑制脑组织细胞凋亡,起到脑保护作用,且作用效果优于单纯hUC-MSCs移植。

象皮生肌膏预处理的骨髓间充质干细胞源外泌体对人脐静脉内皮细胞血管生成的影响

目的探讨象皮生肌膏(Xiangpi Shengji Ointment,XPSJO)预处理的骨髓间充质干细胞源外泌体(XPSJO-Exos)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)血管生成的影响。方法制备象皮生肌膏溶液,CCK-8法检测不同浓度象皮生肌膏(0、10、20、50、100、200μg/mL)对骨髓间充质干细胞活力的影响;提取骨髓间充质干细胞中的外泌体(exosomes,Exos)和XPSJO-Exos,分别设为Exos组和XPSJO-Exos组,另设对照组(HUVEC),通过透射电子显微镜观察Exos的形态,采用粒径分析仪检测其粒径;Western blot检测Exos标志性蛋白TSG101、CD9和CD63的表达;采用PKH67标记Exos,观察其能否被HUVEC所摄取;采用CCK-8、划痕实验、小管形成实验、ELISA法检测Exos对HUVEC细胞增殖、迁移、小管形成和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度的影响;采用RT-qPCR检测血管生成相关基因ANG1、PDGF、bFGF、EGF的mRNA的表达。结果10、20、50μg/mL的XPSJO与0μg/mL的XPSJO间细胞活力比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。与0μg/mL的XPSJO比较,100、200μg/mL的XPSJO细胞活力显著降低(P<0.01)。在后续的实验中选用浓度50μg/mL作为药物使用浓度。Exos组和XPSJO-Exos组均有呈球形、膜结合囊泡的典型Exos结构(大多数Exos粒径约为120 nm,且能被HUVEC摄取),并均检测到Exos标志性蛋白TSG101、CD9和CD63的表达。与对照组比较,Exos组和XPSJO-Exos组在72、96 h时细胞活力均显著增强(P<0.01),HUVEC小管数量、迁移率、VEGF浓度均显著增加或升高(P<0.05,P<0.01)。与Exos组比较,XPSJO-Exos组在72、96 h时细胞活力均显著增强(P<0.05),HUVEC小管数量、迁移率、VEGF浓度著增加或升高(P<0.05,P<0.01)。结论XPSJO-Exos能促进HUVEC的增殖、迁移及小管形成,并促进VEGF的分泌。

人脐带间充质干细胞来源外泌体在肾缺血-再灌注损伤中的保护作用及其机制研究

目的探究人脐带间充质干细胞来源外泌体(hucMSC-Exo)在肾缺血-再灌注损伤(IRI)中的保护作用,明确瞬时受体电位阳离子通道蛋白(TRPC)6/聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)1信号通路在该过程中的重要作用及其调控机制。方法采用超速离心法提取hucMSC-Exo,通过透射电子显微镜(透射电镜)、纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹法对其进行鉴定。将SD大鼠随机分成假手术组(S组)、假手术+TRPC6抑制剂SKF96365组(SS组)、肾IRI组(IRI组)、外泌体处理组(EXO组)、外泌体+TRPC6抑制剂SKF96365组(ES组),每组6只。检测血清肌酐和血尿素氮水平,苏木素-伊红(HE)染色观察肾组织病理学改变并行Paller评分,蛋白质印迹法检测大鼠肾组织中坏死性凋亡关键分子,包括受体相互作用蛋白激酶(RIPK)1、RIPK3和混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)、TRPC6和PARP1的表达水平。结果透射电镜下观察到典型茶托样结构,纳米颗粒追踪分析结果显示所提取物质的平均直径为125.9 nm,蛋白质印迹法检测其表面标志CD9、CD63、CD81表达阳性,证实提取物为外泌体。与S组比较,IRI组血清肌酐、血尿素氮水平增加,肾组织病理损伤加重,Paller评分增加,TRPC6、PARP1蛋白相对表达量下降,RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白相对表达量增加(均为P<0.05);与IRI组比较,EXO组血清肌酐、血尿素氮水平降低,肾组织病理损伤减轻,Paller评分降低,TRPC6、PARP1蛋白相对表达量增加,RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白相对表达量下降(均为P<0.05);与EXO组比较,ES组血清肌酐、血尿素氮水平增加,肾组织病理损伤加重,Paller评分增加,TRPC6、PARP1蛋白相对表达量下降,RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白相对表达量增加(均为P<0.05)。结论hucMSC-Exo可减轻大鼠肾IRI所致的坏死性凋亡,其保护机制与TRPC6/PARP1通路激活有关。

人脐血间充质干细胞激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路对脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用

目的探究人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs)调控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路对脑缺血再灌注损伤大鼠周细胞表达和神经功能变化的影响。方法取雄性SD大鼠共72只,随机分组为假手术组、模型组、干细胞组、干细胞+抑制剂组,每组18只。除假手术组外,剩余各组均建立脑缺血再灌注模型。造模成功后,模型组尾静脉注射0.1 mL的磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline,PBS),干细胞组尾静脉注射0.1 mL含有2×106个hUCBMSCs的PBS,干细胞+抑制剂组尾静脉注射0.1 mL含2×106个hUCBMSCs的PBS及腹腔注射PI3K/Akt抑制剂LY294002(0.03 mg/100 g),LY294002每天给药1次,直至处死。术后1、3、7、14 d测定改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,mNSS)。术后7、14 d,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法检测大鼠脑梗死面积,尼氏染色检测大脑皮质缺血半暗带正常神经元细胞数,免疫组织化学法检测大脑皮质缺血半暗带血小板衍生生长因子受体-β(platelet derived growth factor receptor-β,PDGFRβ)阳性周细胞的数量,免疫印迹法检测大脑皮质缺血半暗带PI3K/Akt通路相关蛋白p-Akt及Akt的表达。结果术后7 d,4组各项指标整体差异均有统计学意义(P<0.001)。与假手术组比较,模型组的大鼠正常神经元细胞数[(55.42±4.75)个vs.(8.50±1.64)个,P<0.001]和p-Akt/Akt(1.00±0.00 vs.0.47±0.06,P=0.002)均降低,脑PDGFRβ+周细胞数量[(1.08±0.29)个vs.(13.67±2.47)个,P<0.001]增加;与模型组比较,干细胞组大鼠的mNSS评分[(6.33±0.71)分vs.(4.78±0.98)分,P<0.001]和脑梗死率(32.66%±1.76%vs.14.60%±0.52%,P<0.001)均降低,正常神经元细胞数[(8.50±1.64)个vs.(23.17±1.77)个,P<0.001]、脑PDGFRβ+周细胞数量[(13.67±2.47)个vs.(28.50±3.19)个,P<0.001]和p-Akt/Akt(0.47±0.06 vs.0.83±0.18,P=0.017)均增加;与干细胞组比较,干细胞+抑制剂组的大鼠mNSS评分[(4.78±0.98)分vs.(6.11±0.78)分,P=0.002]和脑梗死率(14.60%±0.52%vs.27.85%±0.59%,P<0.001)均增加,正常神经元细胞数[(23.17±1.77)个vs.(11.83±0.88)个,P=0.003]、脑PDGFRβ+周细胞数量[(28.50±3.19)个vs.(20.33±1.44)个,P=0.007]和p-Akt/Akt(0.83±0.18 vs.0.36±0.11,P=0.003)均降低。术后14 d,4组各项指标整体差异均有统计学意义(P<0.001)。与假手术组比较,模型组的大鼠正常神经元细胞数[(57.08±3.79)个vs.(11.25±5.52)个,P<0.001]和p-Akt/Akt(1.00±0.00 vs.0.53±0.12,P=0.002)均降低,脑PDGFRβ+周细胞数量[(2.00±0.25)个vs.(13.42±1.04)个,P<0.001]增加;与模型组比较,干细胞组大鼠的mNSS评分[(4.89±0.78)分vs.(2.33±0.87)分,P<0.001]和脑梗死率(32.58%±1.96%vs.11.78%±1.92%,P<0.001)均降低,正常神经元细胞数[(11.25±5.52)个vs.(31.00±1.89)个,P<0.001]、脑PDGFRβ+周细胞数量[(13.42±1.04)个vs.(31.42±3.66)个,P<0.001]和p-Akt/Akt(0.53±0.12 vs.0.93±0.12,P=0.004)均增加;与干细胞组比较,干细胞+抑制剂组大鼠的mNSS评分[(2.33±0.87)分vs.(4.44±0.53)分,P<0.001]和脑梗死率(11.78%±1.92%vs.25.25%±2.76%,P<0.001)均增加,正常神经元细胞数[(31.00±1.89)个vs.(13.83±1.04)个,P=0.002]、脑PDGFRβ+周细胞数量[(31.42±3.66)个vs.(20.67±1.42)个,P<0.001]和p-Akt/Akt(0.93±0.12 vs.0.53±0.09,P=0.005)均降低。结论hUCBMSCs可能通过激活PI3K/Akt通路促进周细胞的存活募集,发挥神经保护的作用,进而促进脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能恢复。

人类脐血来源的间充质干细胞向软骨和成骨细胞分化的实验研究

取足月剖宫产健康新生儿脐血,应用密度梯度法分离脐血单个核细胞,利用形态学特点和流式细胞仪检测细胞表面标志,鉴定和获取间充质干细胞。应用软骨诱导剂(10 ng/ml TGF-β、100 ng/ml胰岛素、10-7mol/L地塞米松、6.25μg/ml转铁蛋白)和成骨诱导剂(10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/ml维生素C、10-7mol/L地塞米松)定向诱导分化培养,以检测其是否具有分化能力。脐血来源的间充质干细胞表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD166、HLA-AB,不表达CD34、CD45、HLA-DR。诱导分化21 d后,甲苯胺蓝染色和von-Kossa染色均显示阳性,免疫细胞化学结果显示脐血来源干细胞经软骨诱导后表达Ⅱ型胶原。表明脐血中存在着间充质干细胞,可在体外扩增培养,具有分化成软骨细胞与成骨细胞的能力。

低氧支持的脐带间充质干细胞对脐血单个核细胞体外扩增的影响

目的:探讨低氧支持的脐带间充质干细胞(UC-MSC)对人脐血单个核细胞的体外扩增的影响。方法:将分离的脐血单个核细胞(MNC)接种在预先建立的UC-MSC层上,在低氧(3%O2)条件下分组培养,实验分组为常氧(常氧^(+)脐血MNC)、低氧(低氧^(+)脐血MNC)、UC-MSC(常氧^(+)UC-MSC^(+)脐血MNC)、UC-MSC^(+)低氧(低氧^(+)UC-MSC^(+)脐血MNC)共4组。为进一步探讨SCF^(+)FL^(+)TPO(SFT) 3种因子组合在低氧支持的UC-MSC培养体系中脐血MNC体外扩增的作用,实验进一步分组为A(常氧^(+)UC-MSC^(+)SFT^(+)脐血MNC)、B组(低氧^(+)UC-MSC^(+)脐血MNC)、C(低氧^(+)UC-MSC^(+)SFT^(+)脐血MNC)共3组,培养0、7、10、14 d检测各组总有核细胞数(TNC)、 CD34^(+)细胞数、集落形成单位(CFU)数及CD34^(+)CXCR4^(+)、CD34^(+)CD49d^(+)、CD34^(+)CD62L^(+)细胞数并进行比较分析。结果:UC-MSC^(+)低氧组较低氧组、UC-MSC组能有效地扩增脐血TNC、CD34^(+)细胞、CFU数(P<0.05),并可明显提高脐血CD34^(+)细胞上黏附分子和CXCR4的表达(P<0.05);经过14 d的培养,C组各时间点检测指标水平均明显高于A、B组(P<0.05),A组7、10 d扩增效果明显优于B组(P<0.05)。结论:低氧支持的UC-MSC可有效扩增脐血造血细胞,加入SFT因子组合可明显扩增脐血MNC并能提高脐血CD34^(+)细胞上黏附分子和CXCR4的表达。

人脐血间充质干细胞移植治疗大鼠急性肝损伤

目的：探讨人脐血间充质干细胞对急性肝损伤大鼠模型的治疗作用。方法：体外培养人脐血间充质干细胞。60只SD大鼠随机分为3组,各20只：空白对照组、模型对照组、治疗＋模型组。模型对照组大鼠采用体积分数50%四氯化碳橄榄油溶液腹腔注射造成急性肝损伤疾病模型,测定ALT/AST水平、肝脏切片HE染色评估造模效果。治疗＋模型组大鼠进行开腹手术,肝脏局部多点注射人类脐血间充质干细胞悬液（3×106~5×106/只）,24h后采用体积分数50%四氯化碳橄榄油溶液腹腔注射诱导急性肝损伤疾病模型。分析移植后24h实验动物存活率、肝功能改善情况及移植细胞的肝内分化情况。结果：体外培养的人脐血间充质干细胞符合间充质干细胞的一般生物学特性。模型组与治疗＋模型组实验动物存活率有统计学差异（P〈0.05）。两组实验动物肝功能（AST/ALT水平）间差异有统计学意义（P〈0.05）。移植细胞在受试动物肝脏内呈人类肝样细胞方向分化趋势。结论：人间充质干细胞移植可提高急性肝损伤大鼠模型的存活率。

补肾活血解毒方联合脐带间充质干细胞外泌体移植对急性肝衰竭的影响

目的:探讨中药补肾活血解毒方联合大鼠脐带间充质干细胞外泌体(UCMSCs–EXO)移植调控转化生长因子β1(TGF–β1)/Smad通路对急性肝衰竭模型肝细胞凋亡和肝功能的影响。方法:取健康成年SD大鼠,随机分组给药后制备含药血清。取健康SD大鼠随机分为联合给药组、外泌体对照组、中药对照组、空白对照组和正常组,除正常组外均进行造模成功后并给药处理,对大鼠肝功能指标进行测定。肝卵圆细胞和原代肝细胞培养后分别加入不同的含药血清,孵育后诱导细胞凋亡。凋亡诱导结束后,细胞计数试剂盒–8(CCK–8)法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;免疫荧光法检测凋亡肝细胞TGF–β1表达,Western blot法对细胞中Smad2/3磷酸化(P–Smad2/3)、Smad7、TGF–βⅡ型受体磷酸化(P–TβRⅡ)和TGF–β1蛋白表达进行检测。结果:联合给药组、外泌体对照组、中药对照组大鼠的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平均低于空白对照组大鼠(P<0.05),且联合给药组大鼠的AST和ALT水平低于外泌体对照组、中药对照组大鼠(P<0.05);联合给药组细胞活性高于外泌体对照组和中药对照组(P<0.05);联合给药组凋亡细胞少于外泌体对照组和中药对照组(P<0.05);联合给药组的TGF–β1表达低于外泌体对照组、中药对照组细胞(P<0.05);联合给药组P–TβRⅡ、P–Smad2/3、TGF–β1蛋白表达低于外泌体对照组和中药对照组,Smad7蛋白表达高于外泌体对照组和中药对照组(P<0.05)。结论:中药补肾活血解毒方结合UCMSCs–EXO能够改善急性肝衰竭大鼠肝功能并且能够通过调控TGF–β1/Smad通路抑制急性肝衰竭模型肝细胞凋亡。

脐血混合培养纯化人间充质干细胞及生物学特性研究

目的探讨体外分离、混合培养纯化人脐血间充质干细胞的适宜体系,观察该人脐血间充质干细胞生物学特性。方法收集孕足月新生儿脐血,每3份脐血[(70—100)ml/份]混合;采用1.077 g/ml的淋巴细胞分离液(Ficoll)以1 500 r/min密度梯度离心法分离脐血中的单个核细胞,在Mesencult培养基中贴壁培养筛选人脐血间充质干细胞,显微镜下观察细胞生长形态变化,细胞计数并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞抗原表达,分析细胞周期;体外诱导脐血间充质干细胞成脂、成骨分化。结果密度梯度离心法所获得的单个核细胞,在培养基中培养约3—5 h开始出现贴壁生长,24 h后贴壁细胞增多,呈明显纺锤状,10 d后开始出现细胞克隆,3周后呈漩涡状生长。原代培养时间为15 d,P1代倍增时间为26 h。流式细胞仪鉴定:贴壁生长的细胞表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45。分化潜能鉴定体外培养细胞可以成脂、成骨分化。结论所贴壁培养出的细胞的生长形态、流式表形、分化潜能具有人脐血间充质干细胞生物学特征,混合培养可以提高间充质干细胞培养成功率,实验中采用的培养体系适宜人脐血间充质干细胞的分离培养。

脐血间充质干细胞移植对脑梗塞大鼠模型神经功能的影响

目的 探讨人脐血间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能的影响。方法 选取48只SD大鼠,随机分为4组,每组12只,分别为空白组、模型组、PBS组和移植组。空白组为正常老鼠,不做任何处理,其余3组均采用线栓法制作脑梗死大鼠模型,模型组只做成大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型,移植组于造模成功后1 d经鞘内移植含1×106个脐血间充质干细胞的细胞悬液10μL;PBS组经同样方法注射10μL PBS溶液。移植后第1、3、7天进行神经功能评分,于第3、7天进行尼氏体计数、TUNEL法检测神经元细胞凋亡率、TTC评价梗死体积。结果 (1)与空白组相比,模型组和PBS组的神经功能评分、梗死体积及细胞凋亡数明显增加,尼氏体明显减少(P<0.05);(2)与模型组和PBS组相比,移植组梗死体积明显减小,细胞凋亡减少,尼氏体明显增多,神经功能评分明显改善(P<0.05)。结论 脐血间充质干细胞通过抑制细胞凋亡,缩小梗死体积,有效促进了脑梗死大鼠神经功能的恢复。

miR-200a对人骨髓间充质干细胞增殖、凋亡、成血管分化的作用机制

目的探讨miR-200a对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC)增殖、凋亡、成血管分化的作用机制。方法将hBMSC分为3组,对照组;阴性对照组(NC组),NC组转染NC质粒;试验组,试验组转染MIR-200a inhibitor质粒,MTT法检测各组细胞24、48h和72h细胞活力,流式细胞法检测各组细胞凋亡水平,Western blot检测细胞凋亡关键蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)和Caspase3表达水平,通过miRDB软件对miR-200a的靶向基因进行预测,双荧光素报告实验验证靶基因,Western blot实验检测靶基因转化生长因子β_(2)(TGF-β_(2))及成血管分化关键分子血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)的表达水平。结果与对照和NC组相比,试验组细胞增殖受到显著抑制,并且随着时间增加抑制能力增强(r=0.63);细胞凋亡显著增加,凋亡相关蛋白Bcl-2表达显著降低,Caspase3表达显著增加,结果均具有显著的统计学意义(P<0.01)。miRDB预测结果表明,TGF-β_(2)为miR-200a靶基因,荧光报告基因实验验证了其靶向性。Western blot结果表明,相比与对照组和NC组,试验组细胞TGF-β_(2)、VEGF、Ang-1表达水平均显著降低(P<0.01)。结论下调miR-200a可以抑制hBMSC活性,诱导细胞凋亡,抑制成血管分化作用,其机制可能通过靶向调控成血管分化关键因子VEGF和Ang1相关。

人类脐带血间充质干细胞的培养及鉴定

目的对人类脐带血中的有核细胞进行分离培养及鉴定,观察能否得到间充质干细胞。方法抽取人类脐带静脉血,进行细胞分离和培养,并进行荧光激活细胞分析。结果脐带血中间充质干细胞与骨髓中的类似,其外表呈纤维样;流式细胞术鉴定结果表明这种细胞能表达CD29、CD44、CD90、CD95、CD105、CD166以及MHCⅠ(组织相容性抗原复合体Ⅰ),但不能表达CD14、CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、CD117、CD152以及MHCⅡ(组织相容性抗原复合体Ⅱ);并且具有分化成骨细胞和脂肪细胞的潜能。结论可以从人类脐带血中成功分离培养得到间充质干细胞。