人类隐花色素蛋白(Homosapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与FAD结合状态的NMR研究

隐花色素(Cryptochrome,CRY)蛋白是一种对蓝光敏感的蛋白,它与辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)形成的自由基电子对在调节生物钟及感应磁场中发挥重要的作用,但目前对人类CRY(Homo sapiens CRY,HsCRY)蛋白的结构功能研究尚未见报道.以HeLa细胞RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到全长1 761bp的HsCRY1基因,把其克隆到HTA杆状病毒转座载体上,经菌落PCR和测序鉴定出阳性重组转座载体HTA-HsCRY1,转化含有病毒杆粒bacmid的DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选和PCR检测获得重组质粒BacmidHsCRY1,转染昆虫Spodoptera frugiperda(sf9)细胞,产生的病毒感染昆虫细胞获得分子量为66kDa的目的蛋白HsCRY1.蛋白经Western Blot和SDS-PAGE鉴定,并利用镍亲和层析柱纯化,结果100mmol/L及200mmol/L咪唑均可洗脱下较纯的目标蛋白.同源蛋白的多序列比对表明HsCRY1的W320,W374以及W397可能组成传递电子的色氨酸三联体,对3个突变蛋白W320F,W374F以及W397F进行表达纯化.31P核磁共振检测蛋白与辅因子FAD的结合状态,发现与自由态FAD的磷谱相比,野生型HsCRY1及突变体3(W397F)结合的FAD的化学位移发生了改变,而HsCRY1突变体1(W320F)以及突变体2(W374F)不结合FAD.本实验成功构建了表达HsCRY1蛋白及其色氨酸突变蛋白的杆状病毒-昆虫表达系统,并通过核磁共振的方法发现色氨酸突变位点会对蛋白与FAD的结合产生影响.

拟南芥隐花色素2(cry2)的光激发与光钝化机制

光是影响地球上所有生命体系的重要环境因子，动植物均通过光受体蛋白感受感知光信号。其中，隐花色素（cryptochrome）是唯一一类在生命进化过程中极为保守的蓝光受体蛋白。在植物系统中，隐花色素参与蓝光诱导的幼苗形态建成和花发育等过程；而在哺乳动物中，隐花色素主要参与生物钟与昼夜节律调控。

铁硫簇结合蛋白1的磁感应能力

目的探究铁硫簇结合蛋白1(ISCA1)磁场刺激后对细胞钙内流的影响。方法(1)制备携带ISCA1基因的质粒、携带Magneto 2.0序列的质粒和空载质粒,且3种质粒均携带mCherry基因,包装成慢病毒感染HEK293A细胞,荧光显微镜观察慢病毒感染效率。(2)免疫共沉淀技术检测ISCA1与隐花色素1(CRY1)和CRY2蛋白之间的结合。(3)在磁场(40 mT,0.1 Hz,90%占空比)条件下,活细胞钙成像技术检测高表达ISCA1或Magneto 2.0细胞的钙内流。结果(1)在HEK293A细胞中观察到红色荧光,表明慢病毒转染成功。(2)外源ISCA1蛋白与内源CRY1或CRY2蛋白不结合。(3)与加磁前相比,加磁后Magneto 2.0组细胞的绿色荧光强度增加(1.8±0.5)倍(P<0.05),即发生显著的钙内流;而ISCA1组及细胞对照组细胞的绿色荧光强度与加磁前相比无显著差异。结论外源高表达ISCA1的细胞在此磁场条件刺激后未引起细胞钙内流,无明显磁感应性。

人体内隐秘小蛋白大规模发掘研究开辟宏微生物基因组新领域

人体及其内部的微生物群系(microbiome)共同构成一个共生“微生态”体系。这些微生物们定居在人体内的黏膜和与外界环境接触的皮肤环境中,其个体数量和人体的体细胞数量相当,并且编码的基因比人类基因组多得多。

新型隐球菌感染诊断的现有实验室技术与进展

新型隐球菌感染是艾滋病的一种严重的机会性感染,准确、快速地检测新型隐球菌感染对于指导临床早期诊断和及时干预至关重要。本文综述了新型隐球菌感染的现有实验室检测方法和新兴发展检测技术,为早期、快速、高效地诊断新型隐球菌感染提供参考。

生物钟蛋白CRY1抑制AngⅡ诱导的小鼠主动脉平滑肌细胞表型蛋白标志物变化

目的探讨生物钟(circadian clock)相关蛋白隐花色素1(CRY1)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化中的作用。方法将VSMCs分为对照(control)组和实验组,用不同浓度AngⅡ处理VSMCs不同时间,RT-PCR和Western blot检测收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、合成型标志物骨桥蛋白(OPN)及CRY1 mRNA和蛋白的表达;分别构建CRY1的干扰RNA(siCRY1)、YAP1的干扰RNA(siYAP1)进行基因沉默,构建CRY1的过表达质粒(pcDNA-CRY1)进行过表达,RT-PCR、Western blot双重验证各基因组mRNA和蛋白的表达;将VSMCs分为4组,对照组、AngⅡ组、AngⅡ+siCRY1组、AngⅡ+pcDNA-CRY1组,将siCRY1、siYAP1、pcDNA-CRY1转染至经AngⅡ处理VSMCs中,RT-PCR和Western blot检测α-SMA、OPN、CRY1、YAP1 mRNA和蛋白的表达及CCK-8法检测细胞增殖情况。结果不同浓度AngⅡ刺激VSMCs不同时间后,VSMCs收缩型标志物表达减少,VSMCs合成型标志物表达增加,CRY1表达减少;转染siCRY1、siYAP1、pcDNA-CRY1处理VSMCs后,CRY1在siCRY1组中表达下降,在pcDNA-CRY1组中表达升高,YAP1在siYAP1组中表达下降,在siCRY1组中表达升高;转染siCRY1进一步减少AngⅡ诱导VSMC收缩型标志物的表达(P<0.05),增加合成型标志物、YAP1的表达,以及促进VSMCs的增殖(P<0.05);转染pcDNA-CRY1质粒增加AngⅡ诱导VSMCs收缩型标志物的表达(P<0.05),减弱合成型标志物YAP1的表达(P<0.05)及抑制VSMCs的增殖(P<0.05)。结论生物钟蛋白CRY1抑制AngⅡ诱导的小鼠主动脉VSMCs表型蛋白标志物变化和增殖,该过程可能与Hippo-YAP信号通路有关。

隐花色素蛋白光依赖磁感应机制研究进展

隐花色素(Cryptochrome,CRY)蛋白是一种对蓝光敏感的蛋白,在植物中主要调节生长及发育,是果蝇等昆虫光信号的接收者,在哺乳动物中扮演调节生物钟的角色。CRY蛋白作为磁光信号感受器受到广泛关注,其结构中的保守的色氨酸三联体与辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)间自由基电子对是CRY蛋白具有光依赖的磁感应功能的关键因素。该文对CRY蛋白的分类及结构特征、光依赖磁感应机制的研究进展进行了综述,并对目前CRY蛋白研究中存在的问题及未来研究方向进行了展望。

隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白相互作用及其在褐飞虱发育与生殖中的作用

【目的】在真核生物中验证隐花色素蛋白(Cryptochrome)/铁硫簇蛋白(Iron-sulfur cluster assembly1)的相互作用,研究2种蛋白在褐飞虱Nilaparvata lugens发育和生殖过程中的作用,为二者在磁感受机制中的协同作用及磁场对昆虫生理状态的调控机制提供依据和新的研究方向。【方法】通过酵母双杂交系统对褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白/Ⅱ隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白的相互作用进行验证。在褐飞虱3龄若虫和羽化第1天成虫中建立Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因RNAi(RNA interference)沉默模型,并采用RT-qPCR检测2个基因沉默效率,统计沉默虫体的若虫历期和产卵量。【结果】褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白存在相互作用,而Ⅱ隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白不存在相互作用。褐飞虱3龄若虫和羽化第1天成虫中成功建立Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因RNAi沉默模型,在注射dsRNA后第2天、第4天和第6天时,2个基因的沉默效率均能达到70%以上。Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因沉默虫体的若虫历期无明显变化,但是产卵量受到显著性抑制。【结论】褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白存在相互作用,二者在褐飞虱生殖过程中发挥重要作用。

节律基因隐花色素2在银屑病小鼠模型及HaCaT细胞中的表达变化及机制研究

目的探讨节律基因隐花色素2(CRY2)在银屑病小鼠模型及HaCaT细胞中的表达变化及其机制。方法咪喹莫特诱导小鼠模型实验:12只C57BL/6雌鼠随机均分为咪喹莫特组(连续外用咪喹莫特乳膏5 d诱导构建银屑病小鼠模型,6只)和对照组(不予任何处理,6只),第6天处死小鼠,取其背部皮肤组织,免疫荧光染色检测表皮中CRY2的表达。HaCaT细胞转染实验:使用小干扰RNA(siRNA)技术在HaCaT细胞中敲减CRY2的表达(siRNA-CRY2组),以siRNA-NC组作为对照,5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色检测HaCaT细胞增殖活力,实时荧光定量PCR(qPCR)检测HaCaT细胞中趋化因子mRNA表达水平,Western印迹检测细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白的磷酸化水平。肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激动物和细胞实验:12只C57BL/6雌鼠随机均分为TNF-α组(小鼠耳部皮下连续注射TNF-α溶液6 d,6只)和磷酸盐缓冲液(PBS)组(注射等量的PBS,6只),第7天处死小鼠,取其耳部皮肤组织,免疫荧光染色检测表皮中CRY2的表达;用50 ng/ml TNF-α刺激CRY2基因敲减的HaCaT细胞12 h(siRNA-CRY2+TNF-α组),以siRNA-NC+TNF-α组作为对照,qPCR检测各组细胞中趋化因子mRNA的表达。统计分析采用两独立样本t检验。结果免疫荧光染色显示,咪喹莫特组小鼠背部表皮层中CRY2蛋白的表达(0.94±0.23)显著低于对照组(2.30±0.25,t=3.99,P=0.016)。HaCaT细胞转染实验:siRNA-CRY2组EdU阳性细胞比例(48.13%±10.97%)显著高于siRNA-NC组(38.23%±0.81%,t=5.00,P=0.007),且siRNA-CRY2组趋化因子CXCL1、CXCL8 mRNA相对表达量及p-ERK1/2蛋白相对表达量均显著高于siRNA-NC组(均P<0.05),但两组间CCL20 mRNA表达量及ERK1/2蛋白表达量差异无统计学意义(均P>0.05)。TNF-α刺激实验:免疫荧光染色显示,TNF-α组鼠耳表皮组织中CRY2蛋白表达水平(0.37±0.34)显著低于PBS组(2.04±0.17,t=4.38,P=0.012);siRNA-CRY2+TNF-α组HaCaT细胞趋化因子CXCL1、CXCL8、CCL20 mRNA相对表达量均显著高于siRNA-NC+TNF-α组(均P<0.05)。结论CRY2在银屑病小鼠模型中表达降低,促进了角质形成细胞的增殖以及趋化因子CXCL1、CXCL8和CCL20的表达,且TNF-α可能是下调CRY2表达的上游细胞因子。

隐马氏模型在生物序列分析中的应用

随着以功能基因组学和蛋白质组学为主要研究内容的后基因组时代的来临 ,人们面对着“海量”的生物序列数据需要分析处理 .生物序列分析的基本出发点是 :通过计算方法由核酸和蛋白质的序列推导出它们的结构和功能 .依据分子生物学的知识 ,各种数学工具已被广泛地应用于生物序列分析 .其中隐马氏模型就是一种日益受到重视的智能化方法 ,已在生物序列分析中获得了广泛的应用 .

人类也有地磁视力

能够看见地球的磁场。一直被认为是海龟、燕子等这些动物长途旅行家的专属本领．但是人类的眼睛或许也具备这种能力。隐花色素二号蛋白质是感应地球磁场的关键，实验发现将人类的隐花色素二号放进缺乏该蛋白质的果蝇里，可以修复果蝇的地磁定向感应力。果蝇和人类是天差地别的两个物种，但是人类的蛋白质却能在果蝇身上起作用，

蛋白质为王蝶领航

科学家最近发现，王蝶拥有自己独特的生物钟，正是这种生物节奏在调控着诸如睡眠和饥饿等日常事件，同时有助于王蝶将太阳作为自己的指南针，以便从加拿大飞到墨西哥。科学家绘制了王蝶生物钟的基因谱，发现其中有一种被称为隐花色素的蛋白质在起着关键作用，而隐花色素在昆虫和哺乳动物体内都很常见。科学家相信，在王蝶飞行过程中，

科学家发现“隐花色素”光反应原理

近日，福建农林大学的研究团队刊发了论文“拟南芥蓝光受体蛋白——隐花色素2的光激活与失活机制”，标志着福建农林大学在光受体蛋白研究方面取得了重大突破。该研究首次解析了植物蓝光受体蛋白（隐花色素）原初光反应的原理，为未来提高农林作物光合作用效率，精准调控农林作物花期等农业生产关键技术的开发利用提供重要的理论基础，对我国乃至全球农业的基础研究具有重要意义。

植物蓝光受体研究进展

植物蓝光调节的反应主要有向光性、抑制幼茎伸长、叶绿体迁移、刺激气孔张开和调节基因表达等。蓝光反应的有效波长是蓝光和近紫外光(320～400nm),故蓝光受体也叫蓝光/近紫外光受体。植物蓝光受体研究近年来取得较大进展。以拟南芥为例,已得到确认的受体至少有隐花色素(CRY1、2)和向光蛋白(phototropin)两大类。转基因拟南芥对蓝光、紫外光和绿光敏感,并发现CRY1是一个可溶性蛋白。CRY2编码一个核蛋白熏蓝光在转录水平对该蛋白进行调节,它的作用是增加拟南芥对蓝光的敏感性。CRY1和CRY2共同介导了拟南芥植物的向光性。隐花色素的蛋白与辅基之间以非共价键连接,可以吸收蓝光和近紫外光。CRY1和CRY2蛋白之间,尤其是N端相似性很高。向光蛋白目前只发现PHOT1和PHOT2两种,向光蛋白作为丝/苏氨酸激酶蓝光受体含有两个光氧化结构域(LOV)并参与了植物向光性叶绿体运动、气孔开放等。

动物的磁感应

动物迁徙始终是一个未完全解开的谜，跋涉成千上万公里而不迷路，究竟是什么在起导航作用？其生物学原理究竟是什么？

眼非视觉功能在生物感磁过程中的作用

眼的非视觉功能包括生物昼夜节律的调节以及生物感磁。生物感磁是指各种生物包括人类可通过地磁场获取方向位置信息。具有视网膜结构的生物可能是以视网膜隐花色素蛋白作为磁受体,完成生物感磁过程。生物感磁的假说分别是基于化学反应和自由基对的磁感应假说以及光磁耦合的生物指南针假说。这2个假说都认为视网膜上的分子可能是生物感磁的受体蛋白,眼可能是生物感磁的器官。但基于化学反应和自由基对的磁感应假说认为是通过自由基电子自旋方式的改变,影响了视网膜隐花色素蛋白的分子结构,引起下游化学反应产生不同的化学产物,从而感受到磁场的变化;光磁耦合的生物指南针假说指出隐花色素蛋白作为光受体,与另一种磁受体蛋白经过多聚反应形成棒状小体,光信号和磁信号的耦合影响了棒状的复合体指向的变化。这些视网膜上的改变再通过某种途径传输至大脑,从而产生方向感。研究生物感磁有助于从新的角度诊断和治疗眼脑疾病,并且带来磁敏材料领域的革新。本文就眼非视觉功能、生物感磁过程的机制假说和眼非视觉功能在生物感磁过程中可能的作用机制进行综述。

基因剪接花样多

2000年春天,一些基础分子生物学家互相打赌,试图预测DNA测序完成后在人类基因组中所能发现的基因数目.那时估计的基因数最高达到15.3万个.毕竟在大多数人看来,人类要产生大约9万种不同类型的蛋白质,因此我们需要至少同样多的基因来编码它们.

调控植物花期的“开关”已被找到

10月20日,福建农林大学召开'光信号传导研究成果新闻发布会'宣布,国际顶级学术刊物《科学》将发表该校林辰涛教授团队的研究成果'拟南芥蓝光受体蛋白——隐花色素2的光激活与失活机制'。该研究在拟南芥中发现了目前已知的自然界中最古老的光受体——隐花色素的工作原理,可实现对植物开花时间的调节。

鸟类凭毒性物质“看见”地球磁场

科学家认为，鸟类身体内部的“指南针”使它们可以“看见”地球磁场，这种能力对鸟类迁徙至关重要——它们飞过漫漫长路，却不会迷路。鸟类特殊的磁感应能力是由细胞内的若干化学反应决定的，其中光受体蛋白“隐花色素”（cryptochrome）是反应中的重要分子，但它如何参与化学反应至今仍是个谜。美国伊利诺伊大学的研究者们发现，一种有毒的过氧化物很可能参与了决定磁感应能力的化学过程。

前沿

魔鬼式海底火山大爆发改造世界前不久,冰岛埃亚菲亚德拉(Eyjafjallajkull)火山爆发,火山灰笼罩欧洲上空,全球为之瞩目。无独有偶,在针对冰岛附近的挪威海(Norwegian Sea)进行地心钻探和地震数据收集中,发现了海床上散布着宽达700千米的巨大火山口。这说明这一地区曾经发生过剧烈的火山爆发。