人bFGF单克隆抗体的制备及MabF7对黑色素瘤B16的体外抗瘤效应

目的:制备抗人碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)单克隆抗体,并探讨其体外对黑色素瘤细胞B16的抗肿瘤效应。方法:以rhbFGF免疫Balb/C小鼠,用杂交瘤技术制备单克隆抗体;间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,测定腹水型单抗的效价及其Ig亚类;用RT-PCR、细胞免疫组化和双抗体夹心等方法检测黑色素瘤B16细胞中bFGF的表达;用MTT法检测单抗MabF7对B16细胞的体外抑瘤效应;用流式细胞术及DNA琼脂糖电泳技术检测细胞凋亡。结果:共获得19株稳定分泌抗bFGF单抗的杂交瘤细胞株;ELISA效价>105;除MabF8、MabF9为IgG2a外,其余为IgG1;黑色素瘤细胞B16中有bFGFmRNA及其蛋白的表达,且可在细胞培养液中检测到bFGF;经蛋白A纯化的MabF7对B16细胞的抑制作用呈剂量及时间累计效应,抑制率为(39±4.12)%,P<0.01。流式细胞术结果显示,随抗体浓度增加及作用时间延长,肿瘤细胞在G1期前出现明显的亚二倍体期;DNA电泳结果显示,抗体作用后的细胞DNA呈明显的梯度条带。结论:MabF7具有体外抑制黑色素瘤B16细胞增殖作用,其机制与诱导细胞凋亡有关。

单克隆抗体连结光敏物质对脉络膜黑色素瘤细胞的光免疫治疗作用

应用单克隆抗体 IG12连结光敏物质 CMA,形成免疫连结物 Mc Ab-CMA,估价其对体外人眼黑色素瘤培养细胞 OCM43 1的光免疫治疗作用 ,另设 RPMI1846黑色素瘤细胞作为对照组。氩离子 -染料激光波长65 4nm,连结 1mm光导纤维 ,光斑直径 3 5 mm。靶细胞和对照细胞的存活率用 MTT法测得。结果 :靶细胞(OCM43 1)预先与免疫连结物培养 ,激光照射剂量 5～ 40 J/cm2 显示靶细胞存活率随着激光剂量增加而明显降低。在相同激光照射剂量下 ,增加免疫连结物的浓度 ,细胞存活曲线亦随着降低 ,当免疫连结物的量增加超过6μM时 ,肿瘤的光毒作用趋平缓。对照细胞 (RPMI1846)给予相同的照射条件 ,在激光剂量 40 J/cm2 时仍有 74±2 .6%细胞存活。认为单克隆抗体

人黑色素瘤特异性单克隆抗体可变区基因的克隆和序列测定

作者从培养的可分泌人黑色素瘤特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞Leo Mel3提取RNA,反转录成cDNA.用合成的寡核苷酸引物从中扩增了抗体的轩、重链可变区基因,并克隆入质粒.随机挑取阳性克隆各一个进行核苷酸序列分析.见所克隆基因确可编码小鼠抗体的轻、重链可变区。

黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因的克隆和序列测定

目的：克隆黑色素瘤特异性单克隆抗体ＨＢ８７６０可变区基因．方法：从培养的可分泌人黑色素瘤特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞ＨＢ８７６０提取总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ，用合成的一对寡核苷酸引物从中扩增了抗体可变区基因，并克隆入ｐＵＣ１９，挑选出阳性克隆后进行了核苷酸序列分析．结果：所克隆基因分别长３６０ｂｐ和３３０ｂｐ，编码１２０个和１１０个氨基酸，含三个ＣＤＲ区和四个ＦＲ区，并含有维持抗体结构所必需的两个半胱氨酸．计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性．结论：所克隆基因可编码小鼠抗体可变区．

抗人黑色素瘤单克隆抗体在荷瘤裸鼠体内的分布及其定位显像

本文观察了^(131)I 标记的黑色素瘤 McAb HB8759在荷瘤裸鼠体内的生物学分布及放射免疫显像。静脉注射 ^(131)I—McAb48h 和72h 后肿瘤与非肿瘤在5种主要脏器比活性比值(T/NT)分别平均为6.6和9.6,^(131)I—McAb 注射24h 后在移植瘤中明显定位浓集,48～72h 是放射免疫显像的最佳时间。

抗黑色素瘤单克隆抗体的制备

本文用鼠骨髓细胞系NS_1与用黑色素瘤细胞系Cal_1,Cal_(32),Cal_(52),免疫的鼠脾细胞融合制备抗黑色素瘤单克隆抗体。通过使用淋巴细胞分离液MSL和在脾被膜上扎孔,用注射器注入GKN溶液使脾细胞冲出的方法制取脾细胞,使杂交瘤细胞融合率明显提高,并获两株分泌抗黑色素瘤单克隆抗体IgG_1的SM_(167)和SM_(230)细胞株。

恶性黑色素瘤单克隆抗体的研究进展(综述)

恶性黑色素瘤(malignant melanoma,以下简称 MM)有时难以与癌、肉瘤、淋巴瘤鉴别,尤其是转移的无色性 MM.MM 与其他肿瘤鉴别的传统方法有 Masson-Fontana 银染色,Dopa 氧化酶法等,由于 Masson

抗恶性黑色素瘤单克隆抗体在临床诊断和治疗中的研究近况

恶性黑色素瘤的早期诊断和治疗一直是人们所关注的问题。本文综述了放射免疫显像在早期发现头颈部恶性黑色素瘤的研究进展.以及用单克隆抗体携带抗癌药物、毒素、核素对其导向治疗所取得的成就。

^(111)In标记单克隆抗体显像诊断恶性黑色素瘤1例(文摘)

恶性黑色素瘤根据病史，临床表现及病理组织学检查诊断，但有不少病例诊断困难。近年对本病用单克隆抗体(McAb)进行研究，并开始应用于诊断和治疗。作者等曾报道用111^In标记抗人黑色素瘤鼠型McAb(ZME-108)，可诊断本病。本次用于无黑色素性黑色素瘤的诊断，再次确认此抗体的可用性。报告如下。

抗人黑色素瘤单抗HB8759轻、重链可变区基因的克隆和序列分析

目的：获得新的鼠抗人黑色素瘤单抗ＨＢ８７５９轻、重链可变区基因，以便对其进行基因工程改造．方法：采用反转录－ＰＣＲ法（ＲＴ－ＰＣＲ）从杂交瘤细胞中扩增抗体轻、重链可变区基因，测定ＤＮＡ序列，输入计算机分析，并在大肠杆菌中表达．结果：在ＥＭＢＬＧｅｎｅＢａｎｋ１９９５中未发现有与轻、重链可变区（ＶＨ，ＶＬ）基因序列相同的基因．ＶＨ，ＶＬ基因均为单一开放读框，并具有抗体可变区结构特征，ＶＨ，ＶＬ基因分别长３６６ｂｐ，３２４ｂｐ．将ＶＨ，ＶＬ基因重组入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，诱导后可见ＶＨ，ＶＬ分别在４０ｋｕ和３８ｋｕ处有深染的新蛋白带出现，与预计的ＶＨ，ＶＬ与ＧＳＴ的融合蛋白的分子质量相符．结论：ＶＨ，ＶＬ基因均为新发现的基因序列，符合功能重排的鼠抗体可变区基因特征．

黑色素瘤抗体治疗研究进展

黑色素瘤是一类起源于神经嵴黑色素细胞的高度恶性肿瘤,易发生远处转移,转移性黑色素瘤患者的预后很差。近年来,免疫治疗逐渐成为黑色素瘤治疗的新方向,越来越多的免疫药物被用于临床治疗。其中,对T细胞肿瘤免疫研究日益深入,多个有治疗意义的T细胞调节通路位点和共刺激分子被发现,并被用于加强对黑色素细胞瘤的免疫反应。本文就两种单克隆抗体,即程序死亡分子1(PD-1)和抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4),以及两种共刺激分子OX40和4-1BB在近年的研究进展进行综述。

噬菌体呈现技术筛选抗黑色素瘤单链抗体

目的 :制备黑色素瘤单抗的单链可变区片段 ,用于肿瘤的诊断或靶向治疗。方法 :从杂交瘤细胞提取总RNA,分别扩增出轻重链可变区基因(variableregionofheavychain,VH和variableregionoflightchain,VLDNA) ,连接形成单链抗体 (singlechainfragmentvariableregion,ScFv)DNA,将ScFv与载体pCANTAB5E的连接产物转化大肠杆菌TG1 ,经M13K07超感染后 ,获得噬菌体抗体ScFvcDNA文库 ,用黑色素瘤细胞LiBr对重组的噬菌体抗体进行3轮吸附 -洗脱 -扩增亲和筛选后 ,随机挑选克隆经ELISA筛选鉴定。结果:VH、VL和ScFv分别约为360、330、750bp,从随机筛检的30个克隆中获得10个高亲和性噬菌体呈现型ScFv单克隆。结论:用噬菌体呈现技术制备的黑色素瘤ScFv 。

晚期黑色素瘤治疗进展

恶性黑色素瘤(MM)是起源于神经嵴黑色素细胞的高度恶性肿瘤,其发病率占全部恶性肿瘤的1%~3%,60%是由黑痣恶变而来,同时也和遗传、基因突变等因素相关。其恶性程度高,易发生远处转移,预后较差。在我国,黑色素瘤发病率不断增高,每年新发病例已超过10 000例。多数早期患者通过手术能够得到治愈,但对于进展期患者,化疗通常效果不佳,因而寻找新的治疗策略尤为重要。

恶性黑色素瘤细胞光免疫治疗的研究

目的:探讨光免疫治疗(PIT)能否选择性提高人眼黑色素瘤细胞的光毒作用。方法:单克隆抗体IG12连结光敏物质CMA,形成免疫连结物(McAb-CMA),以评价其对体外人眼黑色素瘤培养细胞OCM431的光免疫治疗作用,RPMI1846黑色素瘤细胞与单克隆抗体IG12无交叉反应,作为对照组。氩离子-染料激光波长654nm,连结1mm光导纤维,光斑大小35mm。靶细胞和对照细胞的存活率用MTT法测定。结果:靶细胞OCM431预先与McAb-CMA培养,激光照射剂量5～40J/cm2显示靶细胞存活率随着激光剂量增加而明显降低。在相同激光照射剂量下,增加McAb-CMA的剂量,细胞存活曲线亦随着降低,当McAb-CMA的量增加超过6.7μmol/L时,肿瘤的光免疫杀伤作用趋平缓。对照细胞(RPMI1846)给予相同的照射条件,在激光剂量40J/cm2时仍有74%±2.6%细胞存活。结论:这一结果显示单克隆抗体IG12PIT可选择性提高人眼黑色素瘤的光杀伤作用。

人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人类疱疹病毒8型(HHV-8)包膜糖蛋白K8.1的单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导含重组质粒pGEX-6p-1+K8.1的大肠杆菌BL21表达谷胱甘肽-S-转移酶GST/K8.1融合蛋白,将以包涵体形式存在的融合蛋白进行变性、复性、复性后的GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化。以纯化的GST/K8.1融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选分泌K8.1单抗的杂交瘤细胞株。免疫组化染色(IHC)和Westernblot法鉴定单抗的特异性。结果:建立了一株稳定分泌抗K8.1单抗的杂交瘤细胞株,命名为3G10;IHC和Westernblot法显示,3G10株单抗能特异地识别HHV-8K8.1蛋白。结论:成功制备出抗HHV-8包膜糖蛋白K8.1的单克隆抗体。

抗人类疱疹病毒6型南京分离株E5单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备并鉴定人疱疹病毒6型(HHV-6)单克隆抗体。方法:用纯化的HHV-6南京分离株E5免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA法筛选,间接免疫荧光法、免疫印迹实验等方法鉴定单抗。并采用套式PCR法和ELISA法,在口腔癌中进行了初步的应用。结果:获得了一株分泌抗HHV-6单克隆抗体的杂交瘤细胞系,命名为JA9。单克隆抗体亚类鉴定表明:其为IgG1亚类,轻链为κ。用间接ELISA法检测细胞上清单抗效价为1∶500;单抗腹水滴度为1∶8.0×104。免疫印迹实验结果表明:JA9单抗腹水与约75kuHHV-6E5病毒蛋白结合。口腔癌患者唾液的HHV-6阳性检测率结果分别是:套式PCR法60%,ELISA法40%。结论:成功制备并鉴定一株抗HHV-6南京分离株E5单克隆抗体,为HHV-6进一步的基础研究及临床快速诊断提供可能。

人类ABO血型系统-A抗原单克隆抗体的研制

人类ABO血型的鉴捌，在临床医学、法医学、考古学及人类遗传学等工作中都是常规。传统的抗A、抗B标准血清均来自人血，全国每年用于制备ABO血型试剂所需血清量是十分可观的。应用杂交瘤技术制备血型单克隆抗体，为血型鉴别提供了新的有用工具，将为社会节省大批人血。本文报道的A抗原单克隆抗体，其生物活性稳定，可以取代传统抗A血清，作为新的血型检测试剂。

人黑色素瘤单抗VH-TNF融合蛋白基因的构建和表达

目的：在大肠杆菌中表达人黑色素瘤单抗ＶＨＴＮＦ融合蛋白基因．方法：在人肿瘤坏死因子基因上游插入了抗黑色素瘤单抗Ｍｅｌ３的重链可变区基因，将此融合基因插入大肠杆菌表达系统ｐＧＥＸ２Ｔ的ＧＳＴ基因下游，ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物经凝血酶消化后，测定其对Ｌ９２９细胞的杀伤活性，并进行ＳＤＳＰＡＧＥ，用抗ＴＮＦ抗体进行蛋白印迹分析．结果：序列分析表明融合基因拼接点有正确读框，可表达ＶＨＴＮＦ融合蛋白．将融合的基因插入融合性表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ的ＧＳＴ基因下游，表达出预期的５５ｋｕＧＳＴＶＨＴＮＦ融合蛋白．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ证明可用凝血酶从该蛋白切下２９ｋｕ的ＶＨＴＮＦ蛋白．活性分析表明这一融合蛋白仍具有对Ｌ９２９细胞的杀伤活性．结论：构建并在大肠杆菌中表达了人黑色素瘤单抗ＶＨＴＮＦ融合蛋白基因，表达产物具有对Ｌ９２９细胞的杀伤活性．

人类微小病毒B19结构蛋白VP2的重组表达及单克隆抗体的制备

目的:制备特异性的抗人类微小病毒B19单克隆抗体(mAb)杂交瘤。方法:采用PCR从B19病毒感染患者的血清标本中扩增编码VP2蛋白的基因,经克隆、测序确认后,再分别亚克隆至原核表达载体和真核表达载体。以从SDS-PAGE凝胶中回收的原核表达产物免疫BALB/c小鼠,制备可分泌特异性B19mAb的杂交瘤细胞。以真核表达载体转染CHO细胞后,筛选单细胞表达克隆,将真核表达产物与用原核表达产物为免疫原制备的mAb反应。结果:从患者血清标本中扩增出了1665bp长的DNA,测序结果证实为vp2基因。将该基因克隆至原核表达载体中后,在大肠杆菌中获得了表达。表达产物经SDS-PAGE后,在Mr约为6000处可见1条明显的表达带。Westernblot的结果表明,该电泳带与B19患者的血清呈特异性免疫反应。以从SDS-PAGE凝胶中回收的表达产物为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、克隆化,获得2株分泌特异性的抗VP2mAb的杂交瘤细胞。以这2株杂交瘤细胞制备的腹水可与SDS-PAGE凝胶Mr6000的蛋白条带也出现很强的免疫反应。用ELISA证明以Vp2基因真核表达载体转染的CHO培养上清,也与筛选到的mAb呈阳性反应。结论:成功地制备抗VP2的mAb,为进一步研制可用于B19病毒感染早期免疫诊断试剂盒奠定了基础。