PSF不同功能片段融合蛋白的构建及其在细胞内的分布

目的将人类PSF基因的不同功能片段定向连入pEGFP—C2质粒，使PSF蛋白的各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达，观察其在HeLa细胞中的表达及定位。方法以重组质粒pEGFP—C2-PSF为模板，PCR法扩增出目的基因，将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP—C2上，构建重组质粒pEGFP—C2-PSF（I—V）。将构建成功的pEGFP—C2-PSF（I—V）质粒脂质体法转染HeLa细胞，Western印迹检测融合蛋白的表达，并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位与分布。结果成功构建质粒pEGFP—C2-PSF（I～V），并在HeLa细胞中实现表达；Western印迹检测到融合蛋白GFP—PSF（I～V）；在激光共聚焦显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位。结论人类PSF基因的不同功能片段的重组质粒pEG—FP—C2-PSF（I～V）构建成功，可用于标记PSF蛋白的不同功能片段，为进一步研究PSF在信号转导中的作用机制以及其生物学功能奠定基础。

重组Pegfp-C2-PSF质粒的构建及表达

目的将人类PSF基因定向连人pEGFP-C2质粒，使PSF蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达，为进一步研究PSF蛋白的功能及定位奠定实验基础。方法采用EcoR I和Sal I双酶切方法，从pGEX-2TK-PSF质粒中获得PSF蛋白的cDNA全长；连入pEGFP-C2质粒的C端。将构建成功的pEGFP-C2-PSF质粒转染人HeLa细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果①将该质粒进行双酶切鉴定可见PSF片段；②转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论①PSFcDNA全长成功连入pEG-FP-C2质粒；②PSF蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。